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甜菜碱(glycinebetaine,简称betaine)是广泛存在于生物体内的一种有效的渗透保护物质。高等植物中,以胆碱为底物,经两步酶促氧化生成甜菜碱,中间产物为甜菜碱醛:催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶(cholinemonooxygenase,CMO;EC1.14.15.7),催化第二步反应的酶是甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH;EC1.2.1.8)。菊科作为中央种子目的一员、被子植物的第一大科,蕴含着极其丰富的甜菜碱及其基因资源。本文首次以多种菊科植物为材料,研究了NaCl胁迫对甘菊(Dendranthemalavandulifolium)、黄花蒿(Artemisiaannua)、高山蓍(Achilleaalpina)、紫菀(Astertataricus)等4种植物叶片甜菜碱积累的影响。在此基础上,初步确定甘菊作为研究甜菜碱合成酶基因的适宜材料,进行了盐胁迫条件下甘菊胆碱单加氧酶基因片段的克隆,并研究了BADH基因转录水平上的表达特性。通过本论文的研究可以得出以下主要结论:
1、通过对部分菊科植物叶片的甜菜碱提取和含量测定,获得了一种改进的雷氏盐——紫外可见分光光度法测定植物组织中甜菜碱含量的方法。该法采用蒸馏水浸提植物叶片24h,与雷氏盐反应后经紫外分光光度比色测定其甜菜碱含量,各样品的平行测定变异系数均在5%以下,加样回收率为99.86%~101.04%,具有较高的精密度和准确度,并且简单方便、快速经济。
2、分别对甘菊、黄花蒿、高山蓍、紫菀四种植物材料进行50mmol·L-1、100mmol·L-1、200mmol·L-1、300mmol·L-1、400mmol·L-1NaCl浓度的胁迫处理,结果表明:持续处理7天后,甘菊、黄花蒿、高山蓍、紫菀等四种植物叶片中甜菜碱含量均随盐浓度的增大而增加,且盐处理前后甜菜碱含量的变化高于已测定的其它植物;其中,甘菊幼苗对NaCl胁迫响应最为显著,300mmol·L-1NaCl处理的甘菊叶片中甜菜碱含量为对照的16.67倍。
3、根据已发表的植物胆碱单加氧酶(CMO)基因氨基酸保守序列,设计简并引物,进行RT-PCR与半嵌套PCR,首次从甘菊中获得了核苷酸序列长为603bp、编码201个氨基酸的CMO基因cDNA片段,将其氨基酸序列与GeneBank中已登录的几种植物的CMO氨基酸序列相应片断进行比较,发现同源性为50%左右。该序列包含了植物CMO蛋白保守的两个功能区:
(1)保守的Rieske型[2Fe-2S]结合区的两组Cys-His对:C-X-H-X15-17-C-X-X-H。
(2)保守的多铁原子核结合域“DNYLD”和“HVPYAH”:
4、利用RT-PCR的方法从甘菊中克隆得到一个长度为610bp、编码202个氨基酸的甘菊BADH基因cDNA片段,并用Northern印迹杂交法分析甘菊BADH基因的表达特性。结果表明,50mmol·L-1NaCl处理的甘菊幼苗,其叶片BADHmRNA水平在处理9d时达到最高,约为对照植株的2-3倍,这与在菠菜、甜菜、山菠菜、高粱等的研究结果相类似,说明甘菊BADH基因的表达是受盐胁迫诱导的;而在200mmol·L-1NaCl处理的甘菊成株叶片中,BADHmRNA水平在处理后的1d、2d、3d中均未发生明显变化。