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自交不亲和性(Self-incompatibility；SI)是高等植物中广泛存在的抑制自交促进异交的遗传控制机制。研究表明，自交不亲和性反应是一个多基因协同作用的复杂过程，在模式植物中除花柱中的S-RNase和花粉S基因(SLF/SFB)外，其它非S因子也参与其中。自交不亲和是导致柑桔无籽的重要原因之一。然而，到目前为止，柑桔SI分子机理还不清楚。本论文在已探明无籽沙糖桔无籽原因在于配子体自交不亲和(Gametophytic self-incompatibility，GSI)的基础上，以无籽沙糖桔(SI)和沙糖桔(Self-compatibility，SC)为材料，利用SSH结合芯片技术开展了无籽沙糖桔自交不亲和相关基因的分离与鉴定，并采用生化手段研究这些基因编码蛋白的功能及其在自交不亲和中的作用方式，通过遗传转化分析这些基因是否参与自交不亲和反应，以期进一步了解无籽沙糖桔自交不亲和的分子机理。主要研究结果如下： (1)采用同源序列法克隆了无籽沙糖桔和沙糖桔S-RNase基因，序列比较分析发现，两者cDNA开放阅读框完全相同，而无籽沙糖桔的5’非编码区、3’非编码区和基因组DNA序列分别发生了连续13、9和6个碱基的缺失。半定量RT-PCR和quantitative real-time PCR(qPCR)对其表达特性进行分析，结果表明，S-RNase基因在无籽沙糖桔花柱中表达量明显高于其它部位，是叶片的10倍，花药的5倍；而沙糖桔不同组织表达差异不明显。无籽沙糖桔自交授粉后3 d S-RNase表达量最高，而无籽沙糖桔与沙糖桔异交授粉后3 d S-RNase几乎不表达。Southern杂交结果表明，S-RNase基因在无籽沙糖桔和沙糖桔基因组中均以2个拷贝数形式存在。 (2)分离了无籽沙糖桔雌蕊SI相关基因。通过构建雌蕊抑制性消减杂：交(Suppression-subtractive hybridization，SSH)文库，从正反向文库分别获得了967个和949个阳性克隆。经反向northern筛选，从正反向文库分别获得229和158个上调表达的克隆。得到钙结合蛋白(CaBP)、C2区域蛋白、锌指蛋白、衰老相关的半胱氨酸蛋白酶、S1self-incompatibility locus-linked pollen3.15基因(S1-3.15)、泛素活化酶E1(UBE1)等可能与SI相关的基因，同时得到WRKY2、PIL5、bZIP、SNF2、eIF1、NAC等转录因子。用qPCR技术对这些基因的表达特性进行分析，发现CaBP在无籽沙糖桔花柱和自交后3 d雌蕊中明显上调表达，而S1-3.15和UBE1在沙糖桔子房和花药中的表达量约为无籽沙糖桔的60倍和7倍。 (3)获得了无籽沙糖桔花粉SI相关基因。通过构建花粉SSH文库，正反向文库分别获得1050个和1027个阳性克隆。经反向northern筛选，从正反向文库分别获得230个和238个明显上调表达的克隆。得到F-box基因、Self-incompatibility S1 family protein(S1)、泛素结合酶E2(UBE2)、泛素连接酶E3(UBE3)、RNaseHII等一些可能与SI相关的基因。qPCR分析结果表明，F-box、S1和RNaseHII在无籽沙糖桔花粉中的表达量分别为沙糖桔的5倍、5倍和3倍。F-box、UBE2、S1、UBE3和RNaseHII在无籽沙糖桔自交授粉后3 d雌蕊中的表达量分别为无籽沙糖桔和沙糖桔异交授粉后3 d雌蕊的3倍、2倍、10倍、5倍和5倍。 (4)筛选了无籽沙糖桔自交授粉后72 h花柱中SI相关基因。通过构建自交后72 h花柱SSH文库，正反向文库分别获得570个和473个阳性克隆。经反向northern筛选，从正反向文库分别获得106个和97个差异表达克隆。得到Skp1-like、Autoinhibited Ca2+-ATPase1、U-box domain protein(U-box)、Serine/threonine kinase等可能与SI相关的基因。qPCR分析结果表明，Skp1-like和U-box在无籽沙糖桔子房中明显上调表达，分别是沙糖桔子房表达量的20倍和2倍；无籽沙糖桔自交授粉后，Skp1-like基因和U-box在无籽沙糖桔自交后4 d雌蕊中明显上调表达，约为沙糖桔异交后4 d雌蕊表达量的20倍和800倍。 (5)利用表达谱芯片技术对8个SSH文库获得的9810个阳性克隆进行了筛选和鉴定。结果表明，在9810个基因表达谱的筛选中，1820个基因存在上调或下调表达差异(3倍以上)。16个SI候选基因中5个特异表达的基因极有可能参与了SI反应，2个Self-incompatibility S1 family protein(S1)均在无籽沙糖桔花药中特异表达，表达量分别为叶片的5倍和3倍。Anther-specific protein、Gibberellin receptor和Senescence-associated protein在无籽沙糖桔子房中特异表达，约为沙糖桔子房表达量900倍、200倍和5倍；当无籽沙糖桔自交授粉后，S1和Gibberellin receptor在无籽沙糖桔自交后3 d雌蕊中明显上调表达。随机选取5个基因，比较qPCR与表达谱芯片表达分析结果，两者符合率在88％。 (6)对5个SI相关基因的功能进行了初步验证。利用RACE技术获得了S1-3.15、F-box、CaBP、UBEI和Skp1-like5个基因的cDNA和DNA全长，序列比较和Southern分析发现，这些基因在无籽沙糖桔和沙糖桔中均存在差异。利用毕赤酵母表达系统诱导了CaBP、UBE1和S1-3.153种蛋白，体外花粉萌发实验表明，随着3种蛋白浓度的增加，无籽沙糖桔花粉萌发率均逐渐下降，且达到极显著水平。聚类分析、亚细胞定位和Southern杂交结果表明，F-box基因具备花粉S决定子的特征，具有40个氨基酸的F-box结构域，亚细胞定位于细胞膜，在无籽沙糖桔和沙糖桔的基因组中均以单拷贝数形式存在。构建了F-box、CaBP、UBE1和Skp1-like4个SI相关基因的植物表达载体，并对其进行了烟草遗传转化，Southern表明，外源基因已整合到烟草基因组中。