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聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是目前研究最为广泛的阳离子聚合物非病毒基因载体。大分子PEI如PEI 25k具有强的缓冲能力，能有效压缩DNA，在体外具有较高的转染效率，但所形成复合物不稳定，容易聚集，毒性较大，不可降解，长期使用可造成毒性积聚，所以不适合于体内应用。PEl分子量低于2000时不显细胞毒性，但小分子PEI不能很好地压缩DNA，与DNA通过静电作用仅能成为一个很大的聚集体。转染效率非常低，仅与裸。DNA相若，所以单纯的小分子PEI不能作为基因载体。
基于大分子PEI和小分子PEI应用为基因载体时的特性，本研究设计把多个无毒性的小分子PEI 423接枝至聚乙二醇-聚谷氨酸主链上，改造成可降解的大分子PEI衍生物PEG-b-PLG-g-PEI。聚乙二醇嵌段可提高聚合物/DNA复合物的稳定性，延长基因在血液循环中的半衰期。聚合物可被生物降解，降解位点聚谷氨酸的肽键。聚合物中聚乙二醇嵌段，聚谷氨酸嵌段和聚谷氨酸每个单体单元上的小分子PEI细胞毒性均较低。由该设计思路所制得的聚合物可能成为毒性低但转染效率高的基因载体。
冠心病病人冠脉狭窄通常使用经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)对狭窄冠脉进行介入性治疗，但是术后发生再狭窄机率高。VEGF165基因是被公认为可促进内膜修复，促进内皮细胞生长从而防治PTCA术后再狭窄的基因。但是目前VEGFl65基因治疗血管成形术后再狭窄的研究中所用基因载体一般为病毒载体，病毒载体存在严重的安全性问题；或者是直接给予裸DNA进行治疗，但这样转染效率低。也就是说，暂时没有找到适合的基因载体介导VEGFl65进行血管成形术后再狭窄防治。本研究选用所合成的聚合物PEG-b-PLG-g-PEI介导VEGF165进行防治血管成形术后再狭窄的基因载体，考察其体内治疗兔左侧颈总动脉血管成形术后再狭窄的疗效。
本研究利用聚谷氨酸为骨架，将多个小分子PE1423链接成可降解的大分子PEI衍生物，并引入PEG嵌段，制得聚合物PEG-b-PLG-g-PEI。本文主要考察所合成聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的毒性和生物降解性能；PEG-b-PLG-g-PEI/DNA基因传递系统的物理化学性能及生物学性能。同时考察该传递系统的体外转染效率及体内防治血管成形术后再狭窄的疗效。本文主要讨论以下几方面的内容：
(1)PEG-b-PLG-g-PEI的合成与表征
以ω-氨基聚乙二醇单甲醚引发聚谷氨酸苄酯羧酸酐(BLG-NCA)制得聚乙二醇．聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(PEG-b-PBLG)，并以小分子PEI 423对PEG-b-PBLG中PBLG嵌段进行氨解，把PEI作为侧链接枝于聚谷氨酸主链上，制成以小分子PEI组成的三嵌段聚合物PEG-b-PLG-g-PEI。由1H NMR可知，聚合物PEG-b-PLG-g-PEI中PEI的分子量可由由PLG的链长决定；IR、1H NMR、13C NMR和DSC证实聚合物含有PEG嵌段，PLG嵌段和PEI嵌段的特征峰；CD证明聚合物在有机良溶剂呈现α-螺旋构象，在水溶液中为无规线团构象；GPC分子量分布图显示为单峰，结果显示聚合物PEG-b-PLG-g-PEI为共聚物而非混合物。
(2)聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的生物降解性能研究
以粘度法测定聚合物PEG-b-PLG-g-PEI在水解和酶解前后分子量的变化。聚合物PEG-b-PLG-g-PEI在模拟细胞外液(PBS，pH=7.4)条件下可被水解，8天聚合物可降解20％；在模拟体内酶环境下(木瓜蛋白酶)可被酶解，96h后聚合物降解70％。在聚乙二醇．聚谷氨酸侧链引入阳离子PEI，与引入非离子型小分子相比，会降低聚合物的水解及酶解速度。PEG-b-PLG-g-PEI/DNA复合物在模拟细胞内内涵体环境(pH=5)条件下降解24 h，复合物水解24 h后DNA的检出量与不经水解24 h的复合物的DNA检出量不显显著性差异，说明聚合物的压缩复合DNA的能力在24 h内未受其生物降解性影响。
(3)聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的毒性研究
以MTT法考察聚合物的细胞毒性。由小分子PEI 423组成的聚合物PEG-b-PLG-g-PEI对Hela细胞的细胞毒性与小分子PEI 423细胞毒性接近，lmg/mL的聚合物溶液在含血清或不含血清条件下培育30 min和4 h，细胞存活率在75％以上，显著低于大分子PEI 25k的细胞毒性。聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的24 h和96 h的酶解产物均不显细胞毒性。分别测定聚合物PEG-b-PLG-g-PEI在Hela，HepG2，Bel7402和293细胞中的IC50值，显示PEG-b-PLG-g-PEI的细胞毒性在上述四个细胞系的毒性均低于PEI 25k。利用溶血实验考察PEG-b-PLG-g-PEI的溶血毒性，聚合物浓度为3 mg/mL时溶血率<5％，不显溶血毒性。
(4)PEG-b-PLG-g-PEI/DNA复合物的性能研究
以凝胶电泳实验考察聚合物PEG-b-PLG-g-PEI压缩DNA的能力，GGI 40在N/P 1已可完全压缩DNA，在N/P 2时可完全保护DNA免受DNase I酶降解。DLS法测定聚合物PEG-b-PLG-g-PEI/DNA复合物粒径范围在150 nm附近，SEM和TEM观察复合物粒子形态，粒子结构形态紧密，粒径与DLS法测定相若。复合物粒子稳定性好，长期孵育粒径未见明显增大，未见粒子聚集现象发生。复合物表面电荷15-20 mV。PEG-b-PLG-g-PEI具有较强的缓冲能力，pH 7.4-5.1 GGI 40氨基质子化的百分比为20％，高于PEI 25k。PEG-b-PLG-g-PEI/DNA基因传递系统的物理化学性能和生物性能显示，它比小分子PEI 423和大分子PEI 25k更有优势，证明聚合物PEG-b-PLG-g-PEI可应用为基因载体。
(5)PEG-b-PLG-g-PEI/pEGFP-C1复合物体外细胞转染研究
以流式细胞仪和荧光显微图片考察PEG-b-PLG-g-PEI介导绿色荧光蛋白pEGFP-C1体外转染Hela细胞的转染效率。GGI 40在N/P 20时转染效率达到最大值，转染效率接近60％，均高于常用的阳离子基因载体PEI 25k和市售商品Lipofectamine 2000。由小分子PEI组成的GGI 40/DNA(N/P 20)在HepG2，Bel7402和293细胞的转染效率均高于PEI 25k，分别为14％，65％，77％。血清降低PEG-b-PLG-g-PEUDNA复合物的转染效率，但增加聚合物的用量可改善血清对转染效率有所降低的情况。
(6)PEG-b-PLG-g-PEI介导pEGFP-VEGF 165基因预防和治疗兔颈总动脉血管成形术后再狭窄研究
PEG—b-PLG-g-PEI介导治疗基因pEGFP-VEGF-165体外转染细胞，ELISA法测定细胞培养液上清，VEGF蛋白的表达量为41 ng／mL，VEGF蛋白表达水平显著高于PEI 25k。以RT-PCR法测定经转染细胞，结果显示细胞中含mRNA VEGF，表达水平显著高于PEI 25k。PEG-b-PLG-g-PEI介导pEGFP-VEGF 165转染血管成形术后兔左侧颈总动脉，经PEG-b-PLG-g-PEI／VEGFl65转染后的损伤血管有mRNAVEGF表达。观察经．HE染色法染色的血管切片，血管内膜增生厚度显著低于盐水对照组和PEI 25k基因治疗组，狭窄率仅为17.2％。利用SEM观察GGI40基因治疗组血管，发现内膜被大量新生内皮细胞覆盖，损伤血管内膜修复完整。由上述可初步证明由小分子PEI组成的阳离子聚合物PEG-b-PLG-g-PEI可介导pEGFP-VEGF 1 65治疗血管成形术后再狭窄。
综上所述，本文根据把无细胞毒性的小分子PEI改造成生物可降解的大分子PEI衍生物的PEI改性思路，首次将小分子PEI 423接枝于聚乙二醇-聚谷氨酸主链上而制成的可生物降解的聚合物PEG-b-PLG-g-PEI，聚合物保留了小分子PEI的毒性特性，细胞毒性低，同时也具备大分子PEI良好的结合DNA能力和转染能力，转染效率较高。这为对PEI改性，改善PEI毒性，提高PEI转染效率提供理论依据和实验基础。首次利用阳离子聚合物PEG-b-PLG-g-PEI作为血管成形术后再狭窄基因治疗的基因载体，成功修复损伤血管的内膜，减少内膜增生，为阳离子聚合物作为防治血管成形术后再狭窄基因治疗的基因载体提供研究基础。