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研究背景根据ER、PR、her-2、Ki67的表达情况可将乳腺癌分为预后相对较好的Luminal A型、Luminal B型和预后相对较差的Her-2过表达型、三阴性乳腺癌。作为一种高异质性肿瘤,不同分子分型的乳腺癌患者的预后存在巨大差异,即使在Luminal A型乳腺癌中,仍有一部分患者的预后接近三阴性患者,由此可见目前的乳腺癌分子分型仍不够完善。因此,在乳腺癌各分子亚型中进一步寻找有预后意义的分子标记物具有重要的临床意义。Aur-A作为细胞有丝分裂期的关键激酶,与多种肿瘤的发生有密切的联系,但其是否可作为乳腺癌的独立预后因素仍存在争论。同时Aur-A对乳腺癌患者的预后中的具体分子机制尚不清楚,有待进一步深入研究。实验目的初步探讨Aur-A是否可作为不同亚型乳腺癌中进一步区分预后的更准确的风险标记物。通过分子信号通路的研究,更好的了解Aur-A的生物学功能及其作用机制。实验方法(1)利用310例,具备12年完整随访资料的人乳腺癌组织芯片,进行免疫组化染色,分析Aur-A在乳腺癌组织中的表达及其与预后的关系。通过进一步分层分析了解Aur-A是否能筛选出各型乳腺癌患者中预后不良的亚群。(2)以代表Luminal A型乳腺癌的MCF-7细胞系作为体外实验的研究对象,运用siRNA敲除MCF-7细胞中的Aur-A或使用Aur-A选择性抑制剂Amg900抑制Aur-A的活性,通过克隆形成、CCK-8细胞增殖、划痕实验、transwell侵袭、迁移实验等实验方法研究Aur-A在Luminal A型乳腺癌的增殖及侵袭转移中的作用。用Western blot和RT-PCR方法探索Aur-A发挥相应作用的分子机制。(3)运用MCF-7细胞分别建立慢病毒敲除的荷瘤模型和Amg900抑制剂的药物干预模型,两组模型分别设置相应的阴性对照和空白对照。观察两种模型瘤体生长速度：并运用免疫组化染色检测瘤体Aur-A、Ki67、Cofilin、P-Cofilin、PHH3以及Src的表达水平。实验结果第一部分：Aur-A在浸润性乳腺癌中高表达,310例患者中阳性表达率达到80.65%(250/310), Aur-A的阳性和阴性表达分布与年龄(P=0.451)、病理分级(P=0.318)、腋窝淋巴结转移(P=0.777)、肿瘤部位(P=0.387)、临床分期(P=0.902)、CK5/6(P=0.099)、AR (P=0.512)等无显著相关性：但与肿瘤大小(P=0.0.030)、ER(P=0.044)、PR(P=0.027)、Her-2 (P=0.000)、Ki-67 (P=0.013)、P53 (P=0.029)、EGFR(P=0.036)、Cofilin(P=0.000)、分子分型(P=0.000)等指标具有显著相关(P<0.05)。Kaplan-Meie r生存分析显示,Aur-A过表达是乳腺癌不良预后的独立危险因素。进一步分层分析发现,Aur-A在LuminalA型乳腺癌中的表达与其预后有统计学意义(P=0.03)。单因素Cox回归分析结果示,Aur-A、ER、PR、EGFR、 AR、FAK、Cofilin、Aur-B、分子分型、肿瘤分期等指标具有统计学意义,然而多因素Cox分析中却只有Aur-A 和 Cofilin可作为独立预后因素。结果表明,Aur-A可作为Luminal A型乳腺癌患者预后评估的风险标记物。第二部分：基于第一部分实验,对Aur-A的生物学功能及作用机制展开初步研究。Aur-A在代表Luminal A型乳腺癌的MCF-7细胞株中高表达,使用siRNA敲除MCF-7细胞中的Aur-A或使用Aur-A选择性抑制剂Amg900抑制Aur-A的活化后,观察到其细胞增殖能力、迁移、侵袭能力、划痕愈合能力及克隆形成能力均明显减弱。siRNA敲除细胞内的Aur-A后Cofilin-F-actin通路的磷酸化程度增高,从而减少Cofilin活性的非磷酸化部分,导致Cofilin-F-actin通路的活性降低：另外Aur-A被敲除后上皮间质转化相关分子TGF-β、Snail、Vimentin表达下降,E-cadherin蛋白表达升高；Src、FAK等侵袭转移相关的分子亦发生相应改变。这些信号通路中的改变均有可能是Aur-A导致乳腺癌不良预后的分子机制。第三部分：裸鼠成瘤及抑制剂干预实验结果表明,Aur-A病毒敲除细胞系在裸鼠体内成瘤体积和重量明显小于对照组;在MCF-7裸鼠成瘤模型中给予Aur-A的选择性抑制Amg900可有效的控制肿瘤的生长。同时免疫组化结果示Aur-A敲除后裸鼠体内成瘤中的Cofilin、PHH3等的表达无明显的差异性,但Aur-A、Src、Ki67的表达量明显低于对照组,P-Cofilin明显高表达。结论Aur-A可作为乳腺癌的独立预后因素；对于Luminal A型乳腺癌,其预后意义尤为显著。Aur-A作为上游基因可调控Cofilin-F-actin、Src、FAK 及 EMT相关因子TGF-β、Snail、 Vimentin、E-cadherin等蛋白的表达,通过其它多条侵袭转移相关信号通路的分子共同作用,实现对肿瘤细胞侵袭转移的调控。Aur-A有望成为Lumianl A型乳腺癌预后风险评估的标记物及潜在的治疗靶点。