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低氧是实体肿瘤的重要特征,可以激活细胞内多条信号通路,是肿瘤血管生成的重要促进因素。低氧还可以通过选择素(selectin)和整合素(integrin)介导的通路调节肿瘤细胞与内皮细胞的粘附,并且低氧调节的这种粘附过程与恶性肿瘤的血源性转移以及肿瘤血管新生密切相关。低氧也是造成肿瘤对放、化疗不敏感,产生多药耐药性的重要因为。
即刻早期基因Egr-1的产物是具有锌指结构的转录因子,能在低氧等外界刺激下迅速的高表达,并启动和调控多种下游基因的表达,使细胞对外界的刺激信号产生相应的反应。但是迄今为止低氧环境下Egr-1蛋白在肿瘤的发生、发展方面的功能仍然存在很多未解决的疑问,因此研究在低氧环境下Egr-1在实体肿瘤中的功能,可能为实体肿瘤的治疗提供新的靶点。
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,肝癌的恶性程度高,发生发展迅速,预后不良。因此对其发生和发展的机制,以及改进治疗方法的研究显得极为必要。本课题以人肝癌细胞系BEL-7402为实验对象,采用低氧培养的手段模拟实体肿瘤内部的微环境,探讨Egr-1蛋白在细胞的迁移、粘附等肿瘤转移的关键步骤对作用,以及对肿瘤细胞的增殖和凋亡的影响。
1、低氧可以直接促进肿瘤细胞的迁移、浸润、铺展,以及在基质上的粘附能力,并且上调肿瘤细胞中VEGF的分泌。此外我们还发现低氧可以降低肿瘤细胞中与细胞粘附密切相关的E-cadherin蛋白的表达水平。低氧培养的BEL-7402细胞中肌动纤维丝会发生聚合和重组,在细胞中排列成清晰成束状的应力纤维束。迁移细胞的丝状伪足在低氧条件下也较常氧的细胞明显减少,并且在迁移方向的细胞前端形成明显的板状伪足,这些现象都表现出了促迁移的表型。
2、低氧可以迅速上调Egr-1蛋白的表达,并且低氧促进细胞的转移依赖于Egr-1正常转录因子功能的发挥。使用显性负性突变(dominantnegative)Egr-1抑制其转录因子活性,可以抑制低氧促进的肝癌细胞BEL-7402迁移和粘附的表型。同时免疫印迹和实时定量荧光PCR的结果也显示,抑制Egr-1的转录因子活性,可以恢复由低氧引起的E-cadherin表达量的下降,以及降低E-cadLherin的转录抑制因子Snail的mRNA水平。
3、免疫荧光的结果显示,抑制Egr-1的转录因子活性,可以引起低氧条件下迁移细胞中肌动蛋白丝排列的变化,即低氧引起的肌动蛋白束的崩解和重排现象减弱,细胞中应力纤维的含量增加,说明抑制Egr-1的转录活性可以抑制低氧促进的肿瘤细胞的迁移。
4、MTT和流式细胞检测的结果表明,低氧可能通过Egr-1提高肝癌细胞的活力,使其DNA合成旺盛,并且提高肝癌细胞抗凋亡的能力。
5、低氧能够提高肝癌细胞的抗凋亡能力,这一功能可能是通过Egr-1保护肿瘤细胞的微管实现的。免疫荧光的结果证明,低氧可以保护肿瘤细胞的微管,降低外界刺激对微管的破坏程度,同时低氧还降低了细胞对微管拮抗剂类抗肿瘤药物的敏感性。
综上所述,我们发现即刻早期蛋白Egr-1在低氧引起的肝癌细胞BEL-7402迁移、浸润以及细胞活力和抗凋亡能力的提高过程中起着重要的作用。