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虎杖（Polygonum cuspidatum）为我国传统中药，具有重要的药用价值，但目前有关虎杖抗逆及代谢转录调控的研究尚未见报道。因此，鉴定虎杖中与抗逆和代谢调控相关的转录因子，并研究其对非生物胁迫的应答机制，将为虎杖的遗传改良奠定分子基础。WRKY是植物中的一大类转录因子家族，因在其N端含有由WRKYGQK组成的高度保守的氨基酸序列而得名。近年来，越来越多的WRKY转录因子被报道在植物非生物胁迫响应和代谢调控方面发挥了重要作用。 本研究根据虎杖的转录组数据，分离得到了一个WRKY转录因子，命名为PcWRKY33，并利用酵母单杂交、凝胶阻滞、烟草共表达、实时荧光定量qPCR、转基因植物抗性实验、植物生理指标检测、HPLC等手段对该基因的分子特性和功能进行了分析，所取得的主要结果如下: 1.PcWRKY33基因及其上游调控序列的克隆 利用RACE技术从虎杖中克隆得到PcWRKY33基因全长cDNA序列（GenBank序列号MG779503）。该基因开放阅读框为1449bp，编码含482个氨基酸的蛋白质。PcWRKY33蛋白含有两个WRKYGQK保守结构域，且系统进化树结果显示该蛋白属第Ⅰ类WRKY转录因子。利用接头PCR技术克隆得到PcWRKY33上游1061bp的调控序列。生物信息学分析发现该序列除具有启动子核心启动元件外，还含有四类顺式作用元件:非生物胁迫响应元件、病原体或诱导子响应元件、光信号响应元件和组织特异表达调控元件。 2.PcWRKY33基因表达模式分析 实时荧光定量qPCR结果显示该基因在根中表达量最高。而且PcWRKY33基因受到多种非生物胁迫的调控，包括紫外(UV-C)、脱落酸(ABA)、高盐、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、干旱、温度、乙烯(ET)，表明PcWRKY33基因可能参与多种非生物胁迫应答。 3.PcWRKY33转录因子特性和转录活性分析 洋葱表皮亚细胞定位实验中PcWRKY33∷EGFP融合蛋白只在细胞核中表达。酵母单杂交和烟草共转化实验结果表明只有PcWRKY33和W-box元件同时存在时，下游报告基因才能被诱导表达。体外凝胶阻滞实验表明当PcWRKY33和W-box元件结合时，复合体的迁移率受到了显著“阻滞”。这些实验结果证叫，PcWRKY33能够在细胞核内特异性地与W-box结合而调控下游目的基因的表达。 4.PcWRKY33转基因植物抗盐性及其分子机制分析 对野生型和Pc WRKY33转基因植株盐胁迫下的表型及生理生化指标分析发现，转基因株系的根长、萌发率、存活率、K+/Na+比率和叶绿素含量均低于野生型株系。qPCR结果显示，转基因株系中胁迫相关基因(AtRD29A，AtDREB2B，AtSOS1，AtSOS2，AtSOS3，AtNHX1和AtABF4)的表达量明显低于野生型株系。DAB和NBT染色结果显示转基因株系的着色更深，表明转基因株系中含有更多的活性氧(ROS)。丙二醛(MDA)含量检测结果也证实了转基因株系的细胞膜受到了更大程度的氧化损伤。抗氧化酶活性分析表明，转基因植株具有较低的抗氧化酶活性，导致细胞内ROS的积累。这些实验结果证明，PcWRKY33可能通过下调胁迫相关基因的表达和抑制抗氧化酶活性从而降低植株耐盐性。 5.PcWRKY33转基因植物干旱和ABA抗性分析 对野生型和PcWRKY33转基因植株干旱和ABA胁迫下的表型分析发现:在ABA处理条件下转基因株系的根长、萌发率均低于野生型株系;而干旱处理条件下转基因株系的根长、萌发率与野生型并无显著差异。以上实验结果证明，过表达Pc WRKY33增加了种子萌发期和萌发后期对ABA的敏感性，而对耐旱性并无显著影响。 6.PcWRKY33基因对苯丙烷代谢途径的调控 对野生型与转基因株系中苯丙烷代谢途径相关基因的表达量分析发现，该途径上游AtPAL和At4CL等基因以及木质素合成途径基因的变化并不明显，但黄酮合成途径关键酶基因都显著降低，尤其是AtDFR和AtLDOX。HPLC检测结果表明，转基因株系中原花青素含量显著降低。这些结果证明，PcWRKY33通过对苯丙烷代谢途径多个基因表达的抑制从而降低植株原花青素含量。 综上所述，本实验证明PcWRKY33是一个参与植物非生物胁迫响应和次生代谢调控的Ⅰ类WRKY转录因子。