论文部分内容阅读
p-乳球蛋白(BLG)是牛奶中的主要蛋白,要占到乳清蛋白总量的一半以上,被认为是导致乳过敏症的过敏原。降低羊奶中的β-乳球蛋白含量,能使羊乳在食品工业中得到更广泛的应用。而经典的生化手段在去除羊乳中的p-乳球蛋白过程繁杂、副产物多、成本较高,不易推广使用。因此利用分子育种手段生产BLG基因敲除奶山羊将为解决这一问题带来希望。锌指核酸酶(ZFN)技术可以针对设计好的基因组靶序列高效、安全地进行修饰,生产转基因动物。模块拼装是一个快速,便捷,开放源码的锌指核酸酶合成方法。然而,这阻碍了多步建设,低效率的编辑和脱靶裂解生物技术。BLG是唯一一个被成功修饰的反刍动物基因,打靶的ZFNs由Sigma-Aldrich公司合成。在本研究中,利用重叠PCR法优化建立了一套快速、便捷、高效的模块拼装锌指核酸酶构建法。利用这套优化体系,设计并合成了6对靶向山羊BLG基因第一外显子的锌指核酸酶组合。在设计锌指核酸酶的同时,我们还利用分子建模的方法对设计的锌指核酸酶蛋白结构以及靶片段结合效果进行预测并进行评估,预测结果与实验结果进行比较,以期提供一种预测人工构建蛋白功能以及合成预筛选的方法。构建好的锌指核酸酶被用于转染山羊胎儿成纤维细胞,转染后72小时提取基因组DNA,对打靶区域进行PCR扩增,利用T7E1酶切法进行突变检测,根据打靶效率筛选出了一对打靶效率最优的锌指核酸酶组合。这对筛选出的锌指核酸酶组合被用于体外转录生产mRNA,为以后利用锌指核酸酶nRNA进行胚胎注射,生产BLG敲除转基因奶山羊打下了基础。