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柑橘黄龙病是目前严重危害世界柑橘生产的一种毁灭性病害,俗称柑橘的“癌症”,该病几乎危害柑橘属的所有栽培品种,包括橘类、甜橙类和柑类等。由于缺乏有效的药剂来防治该病害,植株得病后之只能挖除,造成重大损失。柑橘黄龙病的田间症状复杂多变,田间易与一些生理性病害混淆。快速准确地诊断柑橘黄龙病,对于黄龙病的防治具有重要的意义。
本论文利用受黄龙病侵染的柑橘叶片会累积淀粉这一病理变化,结合碘遇淀粉变蓝的反应,设计出了一套用于田间的快速检测黄龙病的方法。并通过与实时荧光PCR的结果比较,评价了该方法检测黄龙病的灵敏性与可靠性。通过比较引物ITSAf/ITSAr与引物OI1/OI2c、Nested-PCR、实时荧光PCR在166个柑橘样本上的检测结果,评价引物ITSAf/ITSAr检测Candidatus Liberibacter asiaticus的特异性和敏感性。
主要研究结果如下:
1、通过对感染黄龙病叶片和健康叶片的切片显微观察,发现感病叶片的栅栏细胞和薄壁组织细胞会大量积累淀粉,感病叶片中脉的韧皮部会形成新的韧皮部组织,明显增厚,并且与健康叶片相比,感病叶片的韧皮部细胞混乱,细胞之间的边界不清晰。
2、利用感染黄龙病的叶片会积累淀粉这一病理变化,结合碘遇淀粉会变蓝这一反应,设计了一套快速测定柑橘叶片是否含有大量淀粉的方法。并利用该方法测定了健康叶片和感病叶片积累淀粉的概率,发现健康叶片出现淀粉积累的概率很低,而感病叶片确实会特异地积累淀粉。
3、通过比较发现,在成熟叶片上碘-淀粉反应检测黄龙病的敏感性比嫩叶的要高。而在不同地区、不同种类的柑橘上碘-淀粉反应检测黄龙病的敏感性差异是不明显的。说明感病叶片淀粉的积累是要晚于病原的出现,叶片积累淀粉是需要一定时间的。不同地区、不同种类的感病柑橘叶片都会积累淀粉,而且积累淀粉的概率差异不明显。
4、在不同症状的黄龙病病叶上,碘-淀粉反应检测黄龙病的敏感性是不一样的。说明不同症状的黄龙病病叶,积累淀粉的概率是不一样的。不同症状的出现可能与淀粉累积的情况相关。
5、碘-淀粉反应在黄龙病老病区阳性符合率较高,可以用作田间快速粗筛植株是否带有黄龙病的方法。碘-淀粉反应在黄龙病零星分布区的阴性符合率较高,可以用于监测黄龙病的发生。
6、水害、蛀茎虫害等原因导致的韧皮部损害,也会造成叶片淀粉的积累。采集这些样本做碘-淀粉反应检测黄龙病时,会增加错判率。不同症状的叶片样本,碘-淀粉反应的阳性符合率是有显著差异的。斑驳症状的阳性符合率最高,达94.12%。
7、探寻了引物ITSAf/ITSAr的最佳反应条件,发现56℃是最佳的退火温度。通过与其它PCR引物的比较发现,引物ITSAf/ITSAr检测黄龙病的敏感性和阴性符合率都比单用引物OI1/OI2c要高。引物ITSAf/ITSAr的检测性能是与实时荧光PCR相当的,可用于黄龙病菌的快速检测。