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附睾结构和功能的维持以及基因表达均依赖于雄激素。雄激素的作用则是由雄激素受体(androgen receptor,AR)介导的。然而到目前为止,对AR在附睾内的直接靶基因仍然所知甚少。我们利用ChIP-seq的方法检测了小鼠头部附睾(AR高表达)中的基因组水平的AR结合位点。该方法鉴定了总共19377个AR结合位点,其中绝大部分位于基因间区域和内含子区域,只有7％的结合位点位于转录起始位点上游5kb的区域内。Motif分析显示多达94％的AR结合位点含有保守的雄激素应答元件(androgen response elements,AREs),一些潜在的协同因子结合的motifs也在ARE附近得到了显著富集,其中包括了之前已经报道过的NF1位点和本研究中新发现的AP-2位点。ChIP-qPCR分析表明,检测的AR结合位点中,大部分都有NF1和AP-2的富集,暗示了NF1,AP-2和AR之间的协同调控。AR结合区域与活性染色体区域的标签-组蛋白H3乙酰化相关联,并且在荧光素酶分析中显示出转录调节活性。令人意想不到的是,根据基因组序列比对的结果,只有33.7％的AR结合位点在脊椎动物物种间是保守的,并且在哺乳动物物种间,只有11.2％的AR结合位点含有保守的ARE motifs,这些结果表明AR结合位点在物种间保守性不高。进一步的分析表明,这些结合位点共关联了8190个基因,这些基因广泛地参与了多样的生物学事件。但是雄激素处理前后的小鼠附睾基因表达谱数据显示,这些基因中,只有4.8％受雄激素的调控。雄激素正调控的基因主要参与了脂类代谢过程,雄激素负调控的基因则主要与发育以及生物学过程的调节有关。
除了全基因组水平的AR结合位点的规律分析之外,我们的数据也在单个基因的水平显示了一些新的AR调控的机制,如Crisp1和Fkbp5基因。本研究中发现的一个新的位于Crisp1转录起始位点上游8.4kb的AR结合位点在体内是AR的一个真正的结合靶点,并介导了雄激素对Crisp1基因表达的调控。而之前通过体外实验确认的位于近端启动子区的AR结合位点在体内并不被AR所结合。ChIP-seq结果显示,Fkbp5共含有14个AR结合位点。既包括了之前别的组织中报道过的AR和PR(progesterone receptor,PR)的结合位点,也包括了新的附睾组织特异的AR结合位点。
总而言之,我们的研究提供了一个高分辨率的AR基因组结合位点的图谱,使我们对AR在生理状态下在头部附睾内的调控网络有了一个更深刻的认识。与之前在前列腺癌细胞系和原代肌细胞中的AR.结合位点的研究相比,我们的数据既有某些共性,又显示了某些新的特征,是对之前这些非生理条件下的研究数据的一个有力补充和扩展。
之前的研究表明大鼠附睾尾部特异表达的一个serpin家族成员-HongrES1在精子获能以及受精过程中发挥重要作用。本论文第二部分的工作主要是HongrES1在小鼠中的同源基因mHong1的克隆以及表达特性和功能的研究。mHong1基因位于染色体的12p14区,包含5个外显子和4个内含子。mHong1的全长cDNA包含1257个碱基,编码一个419个氨基酸的蛋白,其中N端的20个氨基酸经预测可能是信号肽。氨基酸组成上与大鼠HongrES1有大约71％的同源性。我们制备了高度特异性和敏感性的抗mHong1的抗体。Northern blot和Western blot以及免疫组化的结果显示mHong1的mRNA和蛋白特异性地在附睾中表达,尤其是在附睾体部和尾部,并且显示出雄激素依赖性,但是睾丸因子非依赖性的表达模式。mHong1蛋白在糖基化修饰以及与精子结合的模式上与HongrES1有所不同。它高度糖基化,分泌到附睾管腔中,并且通过非共价键结合在精子的赤道板区域。我们的这些结果为建立相关动物模型,以及进一步研究HongrES1/mHong1的功能打下了基础。