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近年来,肥胖、糖尿病、代谢综合症等营养相关慢性病的发病呈逐年递增的趋势,已成为世界范围内的流行病。而研究表明胰岛素抵抗是上述疾病发病机制中的关键环节。胰岛素抵抗与营养平衡失调密切相关,膳食营养干预成为改善胰岛素抵抗、防治营养相关慢性病的重要措施。研究发现,亮氨酸不仅仅是一种必需氨基酸,而且是一种重要的营养信号分子,参与了如调节蛋白质合成过程中翻译的启动、胰岛素信号传导、能量代谢等多种重要的生物学过程。尤其是亮氨酸在改善胰岛素抵抗方面的作用受到了越来越多的关注。最新的研究表明:亮氨酸可显著改善高脂膳食引起的高血糖,改善脂肪细胞的胰岛素抵抗。临床上,对于肥胖、2型糖尿病患者高亮氨酸膳食可以降低餐后血糖和胰岛素水平,并有利于稳定血糖水平和改善胰岛素抵抗。但由于研究对象的差异,研究设计的不同,目前的研究结论不尽一致;而且亮氨酸影响胰岛素敏感性的具体机制尚未阐明。骨骼肌是胰岛素发挥效应的主要靶器官之一,负责餐后2/3以上的血糖利用,在胰岛素抵抗的发病中起重要作用。亮氨酸是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)最有效的激活剂。mTOR包括两种蛋白复合体,一种是对雷帕霉素敏感的mTORC1,一种是对雷帕霉素抵抗的mTORC2。mTORC1可在不同的水平影响胰岛素信号传导途径。蛋白激酶B(Protein Kinase B, PKB或AKT)作为胰岛素信号传导通路的下游分子,是胰岛素发挥效应的关键分子。本实验重在探讨亮氨酸对原代培养大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响,在此基础上观察不同阻断剂作用后,亮氨酸对葡萄糖摄取的影响,同时检测AKT、mTOR的蛋白表达水平及磷酸化水平,为研究亮氨酸与胰岛素抵抗的关系和相关机制提供理论依据。本研究主要包括两部分,现将结果报告如下:第一部分亮氨酸对原代培养大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响目的:以原代培养的大鼠骨骼肌细胞为研究对象,观察不同浓度亮氨酸作用不同时间对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响,确定亮氨酸作用的最佳浓度和时间。方法:组织块法培养大鼠原代骨骼肌细胞,不同浓度的亮氨酸(0,0.4,2.0,4.0,8.0 mmol/l)作用80 min或45 min,酶促级联放大反应测定基础状态下和胰岛素刺激下葡萄糖摄取能力。结果:基础状态下,亮氨酸对骨骼肌细胞的葡萄糖摄取无显著影响;亮氨酸对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响具有时间和剂量依赖性;胰岛素刺激状态下,在0~8 mmol/L浓度范围内,亮氨酸在2 mmol/L时对葡萄糖摄取能力的影响达到最大。随着作用时间的延长,亮氨酸增强葡萄糖摄取的能力显著降低。2 mmol/L亮氨酸作用45 min骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力达最大,显著高于对照组(P<0.05)。结论:亮氨酸可显著增强胰岛素刺激下骨骼肌细胞的胰岛素敏感性,并且这种作用与时间和剂量有关。第二部分亮氨酸影响骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力的分子机制目的:渥曼青霉素(Wortmannin,PI-3K抑制剂)处理原代大鼠骨骼肌细胞,模拟胰岛素抵抗,观察亮氨酸对其葡萄糖摄取能力的影响;在此基础上进一步应用mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin),观察葡萄糖摄取能力的变化;测定mTOR、AKT总蛋白及磷酸化蛋白表达水平的改变,深入研究亮氨酸影响葡萄糖摄取能力的分子机制。方法:1. PI-3K抑制剂Wortmannin作用30 min,和/或mTOR抑制剂Rapamycin作用30 min,2 mmol/L亮氨酸和(或)胰岛素干预45 min测定葡萄糖摄取能力。2.细胞经上述处理后,Western blot检测AKT及pSer473 AKT表达水平,mTOR及pSer2448 mTOR蛋白表达水平。结果:1.胰岛素刺激状态下,Wortmannin处理后骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力显著降低(P<0.05)。2mmol/L亮氨酸干预,可显著改善Wortmannin对胰岛素刺激下骨骼肌细胞葡萄糖摄取的抑制作用(P<0.05),与不加亮氨酸相比,葡萄糖摄取增加了61%;Rapamycin单独作用后,骨骼肌细胞的葡萄糖摄取能力也显著降低(P<0.05),亮氨酸干预可显著改善这种作用(P<0.05),与不加亮氨酸相比,葡萄糖摄取能力增加了71% ;当Rapamycin与Wortmannin联合作用后,亮氨酸改善葡萄糖摄取的作用表现得不明显(P>0.05),与不加亮氨酸相比,葡萄糖摄取能力增加了23%。2.胰岛素刺激状态下,Wortmannin处理后显著降低骨骼肌细胞AKT Ser473位点的磷酸化水平(P<0.05)。2mmol/L亮氨酸干预,可显著改善Wortmannin对胰岛素刺激下骨骼肌细胞AKT Ser473位点磷酸化的抑制作用(P<0.05),但对总的AKT表达没有影响;Rapamycin单独作用对骨骼肌细胞pSer473 AKT的表达没有显著影响,亮氨酸干预效果不明显;当Rapamycin与Wortmannin联合作用后,亮氨酸增强Wortmannin处理后胰岛素信号传导关键分子pSer473AKT的表达的作用显著降低(P<0.05)。3. Wortmannin降低胰岛素刺激下mTOR及磷酸化mTOR蛋白表达水平,但在亮氨酸干预后得到显著改善(P<0.05)。当Rapamycin联合Wortmannin处理后经亮氨酸干预,与单独Wortmannin或Rapamycin作用后亮氨酸干预相比mTOR、pSer2448 mTOR的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:亮氨酸可改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗;这种作用不完全依赖于PI-3K胰岛素信号传导通路,可能与其增强AKT磷酸化水平有关;Rapamycin可以抑制亮氨酸对Wortmannin处理骨骼肌细胞葡萄糖摄取、AKT蛋白磷酸化水平、mTOR、pSer2448 mTOR的蛋白表达水平的改善作用,提示mTORC1是亮氨酸改善胰岛素抵抗的重要途径;Wortmannin也可以抑制亮氨酸对Rapamycin处理骨骼肌细胞葡萄糖摄取、AKT蛋白磷酸化水平、mTOR、pSer2448 mTOR的蛋白表达水平的改善作用;在不同条件下,亮氨酸可能通过不同的途径改善骨骼肌细胞的葡萄糖摄取能力。