论文部分内容阅读
目的:全球肝癌发病率和死亡率居高不下,每年约有841,000新发病例和782,000死亡病例,其中约50%来自中国,严重威胁到人类的健康。寻找肝癌潜在发病机制及诱发因素,能早发现、早治疗的任务迫在眉睫。DEN（Diethylnitrosamine,二乙基亚硝胺）诱发癌变过程与人肝癌的过程非常相似,是最广泛应用的肝癌模型。而肝癌的发生和发展是一个复杂的多因素过程,涉及细胞和分子水平的异常变化,关于肝癌发病机制的研究主要集中在细胞信号转导、肿瘤相关基因表达调控等方面。基因芯片能对基因表达的组织特异性、病变特异性进行综合的分析和判断,并迅速将基因与疾病联系起来。mi RNA虽然与肝癌的发生密切相关,但其无明显的细胞特异性,而存在于生殖细胞piwi蛋白具有组织特异性,近年被发现也存在于癌细胞,与piwi蛋白结合的piRNA（Piwi-interacting RNA）在维持DNA完整、抑制转录、翻译等均有重要作用,但关于piRNA/piwi与肿瘤发生的相关研究还在初始阶段。肝癌化疗失败的主要原因是多重耐药性（multi-drug resistance,MDR）,研究表明紫草素具有抗癌作用,不易产生耐药性且副作用小,但具体机制并不清楚。综上所述,本研究以DEN诱导建立的大鼠肝癌模型作为研究对象,测定血清肝癌标志物、免疫、内分泌及相关指标,寻找肝组织差异表达的mRNA和piRNA及相关蛋白,揭示以上因素与肝癌发生发展的关系;以肝癌细胞CBRH-7919为研究对象,检测紫草素对其增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,为探索肝癌发生的分子机制及临床用药提供理论支持。方法:1)选取40只6周龄雄性健康Wistar大鼠,重量在150克左右,分为肝癌模型组（NC）和正常对照组（Md）,其中,肝癌模型组自由饮用浓度为0.1 mg/m L DEN的无菌水,每24小时更换一次,20周后停药（9-12周断药用水代替）,观察肝脏组织病理形态学的改变以及细胞超微结构的变化;ELISA法检测外周血AFP、ASMA、HSP、IL-1、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT等指标的改变;利用芯片技术检测组间肝组织mRNA的差异表达并筛选候选基因,采用RT-q PCR、免疫组织化学、Western-blot检测肝癌组织中候选基因的mRNA和蛋白质的表达水平;2)利用二代测序法检测肝组织差异表达的piRNA;利用motif短序列模式比配算法辨认piRNA临近调控区域加工区域特征进行富集度解析和聚类,结合piRNA定位进行功能基因的分布总结,利用RT-q PCR对piRNA、mi RNA进行定量,通过免疫组化和Western-blot检测肝组织中piwil2、piwil4等基因蛋白质的表达水平,利用CRISPR/cas9基因编辑系统敲除CBRH-7919细胞中的piwil4基因,利用CCK-8、流式细胞术、划痕实验检测细胞的增殖、凋亡及迁移的变化;3)用MTT、流式细胞术、划痕实验以及transwell小室法观察紫草素作用于CBRH-7919细胞后的细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等变化,通过Western Blot法检测紫草素作用CBRH-7919细胞后STAT3、Cyclin D1、piwil4、Bcl-xl蛋白。结果:1)利用改变饮水方式建立了DEN诱导大鼠肝癌模型,成癌率为75%,并避免了实验动物中途死亡,肝癌组肝脏表面粗糙度增加,假小叶、增生灶和大量癌结节形成。与正常对照组比较,肝癌模型组血清AFP明显升高,差异显著（P<0.01）;组间血清ASMA无统计学差异,肝癌模型组与正常对照组血清HSP差异显著（P<0.01）。血清免疫学指标IL-1、IL-6水平降低而TNF-α水平升高（P<0.05）,内分泌指标ACTH和CORT的水平降低。mRNA芯片结果显示,31042个mRNA中表达上调的有1639个,表达下调的有360个,应用RT-q PCR法检测结果发现,STAT3和Cyclin D1基因的mRNA表达水平显著升高（P<0.01）;Igfals、G6PC基因的mRNA表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;免疫组织化学结果显示,正常对照组中STAT3和Cyclin D1蛋白表达量少,肝癌模型组STAT3和Cyclin D1蛋白的高表达主要定位在细胞核。western-blot实验结果显示Igfals、G6PC以及Emp1蛋白表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;2)总计发现符合piRNA序列特征的为27439个,mRNA芯片结果显示,与正常对照组相比发现,肝癌模型组中上调表达的piRNA有4个（P<0.05）,分别是piR-64745（piR-rno-51044）,piR-64265（piR-rno-50623）,piR-79437（piR-rno-48177）,piR-64744（piR-rno-51043）,表达下调的有2个（P<0.01）,分别是piR-64143（piR-rno-50518）和piR-64142（piR-rno-50517）。组间表达异常的piRNA靶基因涉及嘌呤嘧啶代谢、氨基酸降解、黏多糖合成、复制、DNA剪切与修复、RNA和蛋白质降解、MAPK信号通路、Ras信号通路众多途径,RT-q PCR显示,与正常对照组比较,肝癌模型肝组织的piR-79437表达增加（P<0.01）、piR-64143表达降低（P<0.01）,肝癌模型组血清中mi R-133b升高（P<0.05）;在肝癌模型肝脏中Piwil2、Piwil4的蛋白高表达（P<0.01）,Piwil4基因敲除后,与肝癌正常对照组和空载组相比,KO组细胞的增殖活性降低（P<0.05）,KO组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）,Piwil4-/-细胞中STAT3、Cyclin D1、Bcl-x L蛋白表达水平均下调,差异显著（P<0.05）;3)紫草素的IC50是11.97μM,作用细胞的浓度确定为5、10、15μM,细胞的存活率随药物浓度的增加而发生梯度变化,具有统计学差异（P<0.05）,FCM结果显示,紫草素浓度为0μM、5μM、10μM、15μM时候,凋亡细胞数量分别为5.50±0.28%、7.88±0.51%、16.05±1.23%、26.88±0.22%,细胞凋亡率逐步上升,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）,划痕实验结果显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应的迁移率分别为52.10±6.12%、47.01±9.01%、34.11±7.18%、13.98±4.52%,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）;transwell实验显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应穿过小室膜的细胞数分别为482.33±55.54%、423.00±35.51%、386.33±68.37%、288.67±50.74%,呈现出浓度依赖性,侵袭能力下降,具有统计学差异（P<0.05）;用15μM紫草素处理CBRH-7919细胞48小时后,STAT3、Cyclin D1蛋白表达下调（P<0.05）,piwil4和Bcl-x L与正常对照组无明显变化。结论:1)使用0.1mg/ml的DEN饮用水诱导大鼠肝癌模型20周（9-12周停药）,成癌率为75%（15/20）,效果良好,观察肝脏组织HE病理结果发现肝癌发生,且血清AFP、HSP均升高,是一种较理想的研究肝癌发生发展的大鼠模型。作者认为免疫相关IL-1、IL-6、TNF-α水平的升高,内分泌相关ACTH和CORT水平的降低,提示肝癌模型中免疫和内分泌功能至少在一定程度上发生紊乱;2)模型肝脏中,STAT3,Cyclin D1等癌基因的过表达和促凋亡基因EMP1低表达共同导致细胞的持续增殖,肝癌模型的G6PC表达的降低便于糖异生的中间产物用于肝癌细胞增殖所需能量的供应和物质的生物合成;3)本研究发现piR-79437、piR-64143的异常表达可能与HCC存在关联,在肝癌的发生和发展中起作用,血清mi R-133b可能是肝癌的潜在标志物,PIWIL2和PIWIL4在肝癌模型组的高表达,提示具有促癌作用,PIWIL4基因敲除细胞中STAT3,cyclin D1和Bcl-xl的表达水平低于对照组,表明PIWIL4基因可能通过作用于STAT3/cyclin D1促进肝癌细胞的增殖,通过STAT3/Bcl-x L抑制其凋亡;4)紫草素使STAT3和Cyclin D1蛋白表达下调,提示其对肝癌细胞生长有抑制作用,同时,紫草素可以促进肝癌细胞的凋亡,抑制其迁移及侵袭,呈现浓度依赖性的关系,但其作用细胞后的piwil4和Bcl-x L的表达水平没有变化,提示紫草素不通过Bcl-x L影响细胞凋亡,具体通过什么途径促进肝癌细胞的凋亡,还需进一步研究。