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目的：乙型肝炎病毒的持续感染是当前严重的全球健康问题之一,也是导致慢性肝病最常见的原因。由HBV持续感染所引起的病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等己成为严重危害人民生命健康的疾病。目前的抗病毒治疗手段疗效不够满意：高剂量重组干扰素的持续应答率仅约30％左右；核苷类似物如拉米夫定虽然抗病毒活性较强,但停药后病毒复制水平快速反跳及耐药病毒株的出现,使得临床抗病毒方案的实施面临极大的挑战。研究表明RNA干扰(RNAi)己在很多领域显示出对目的基因的清除作用,因此,RNAi也成为治疗HBV感染的一种可选的重要手段。为此,本研究的目的：利用pGenesil载体表达的siRNA为工具,观察RNA干扰技术在体内外抑制乙型肝炎病毒复制与表达方面的作用。
方法：1、根据HBV基因编码区序列,设计并合成4对靶向HBVC基因的siRNA模板寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pGenesil载体来构建真核表达载体psil-HBV。2、将HBV特异的siRNA表达载体转染肝癌细胞HepG2.2.15细胞,转染后不同时间观察各siRNA表达载体的抗病毒效应,并筛选出具有最佳干涉效果的HBV siRNA表达载体,观察不同浓度、转染后不同时间该体系对HBV复制和表达的抑制作用。在mRNA水平上用RT-PCR检测HBV mRNA的抑制情况；在蛋白质水平上用ELISA法定量检测培养上清中的HBsAg和HBeAg含量；免疫组织化学染色法检测细胞中HBsAg的表达；Real-time PCR检测细胞内HBVDNA和cccDNA水平。3、在体外实验基础上,将筛选出的抑制HBV效果最佳的siRNA表达质粒psil-HBV1用水压转染法经尾静脉注入HBV转基因小鼠体内,第96h采集标本用ELISA检测HBV血清学标志物；免疫组织化学染色观察肝细胞中HBsAg的表达水平；Real-time PCR测定siRNA对HBVDNA和cccDNA的抑制情况。
结果：1、酶切鉴定结果显示pGenesil载体中的插入片段大小与预期相符,表明寡核苷酸己克隆入重组质粒中；DNA测序证实该重组质粒序列与所设计序列完全一致,表明针对HBVC基因的siRNA表达载体己构建成功。2、体外试验结果显示：(1)在mRNA水平上,RT-PCR结果证实4条siRNA表达载体均能明显降低HBV mRNA的表达。(2)在蛋白质水平上,ELISA结果表明4条siRNA表达载体均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,与对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),其中以psil-HBV1抑制作用最强,它对培养96h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为69.8％和76.1％。免疫组织化学染色结果显示siRNA能抑制细胞内HBsAg的合成。(3)Real-timePCR检测结果显示,siRNA能够高效、特异地抑制HBV DNA的复制,psil-HBV1对培养细胞中HBV DNA的抑制率高达65.5％,与对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)在cccDNA水平,psil-HBV1和psil-HBV2均能明显抑制相应细胞株中cccDNA的扩增,与对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),其中以psil-HBV1抑制作用最强,它对培养96h的细胞中的cccDNA的抑制率为56.4％。3、体内实验结果显示：(1)在mRNA水平上,RT-PCR结果证实siRNA表达载体能明显降低HBV转基因小鼠肝组织中mRNA的表达。(2)质粒注入第96h,siRNA对HBV转基因小鼠血清中HBsAg的最大抑制率为64.7％,与对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫组织化学染色观察到psil-HBV1能明显抑制HBV转基因小鼠的肝组织中HBsAg的表达。(4)Real-timePCR检测结果显示,siRNA对HBV转基因小鼠血清中HBV DNA的抑制率为72.6％。(5)在cccDNA水平,psil-HBV1能明显抑制HBV转基因小鼠的肝组织中cccDNA的扩增,它对培养96h的HBV转基因小鼠的肝组织中的HBVcccDNA的抑制率为48％,与对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：综上所述,我们设计并构建的4条针对HBVC基因的siRNA表达质粒psil/HBV,对HBV的复制和表达均有显著性的抑制作用,这为临床HBV的生物治疗奠定了实验基础,同时,我们构建的真核细胞siRNA表达载体为RNA干扰技术提供了一种新的可选择的技术平台。