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目的原发性肾病综合征是儿童期常见的肾脏疾病,有10%的患儿对激素耐药,对激素敏感的患儿有30%对激素依赖或频复发,对于这些患儿治疗仍较困难,需要寻求其它的药物替代糖皮质激素以缓解病情,避免发生药物的严重毒副作用。国外部分病人的治疗获得成功提示了长春新碱应用于肾病综合征治疗的潜在可能性,我们也发现长春新碱能诱导激素依赖型肾病综合征复发患儿的完全缓解,还有可能降低复发频率且无明显不良反应发生。表现为足突融合的微小病变是儿童原发性肾病综合征最常见的病理类型,阿霉素尾静脉注射大鼠和小鼠使肾脏足细胞发生足突融合产生大量蛋白已经成为研究因足细胞融合而产生蛋白尿的肾病模型。本课题拟用阿霉素诱导损伤的小鼠足细胞、SD大鼠和BLAB/c小鼠阿霉素肾病模型为研究对象,探讨长春新碱对阿霉素损伤的足细胞肌动蛋白骨架是否有修复作用,研究长春新碱对阿霉素肾病模型蛋白尿的治疗效应,分析长春新碱对足突各部位相关蛋白表达的影响,希望通过体内和体外的实验研究来明确长春新碱对肾病综合征的治疗效应并探索可能的作用机制。方法(1)阿霉素对足细胞损伤模型的建立和长春新碱对阿霉素诱导的损伤足细胞的干预:用长春新碱治疗阿霉素诱导的小鼠足细胞24小时和48小时,同时以地塞米松作为治疗对照用药,通过phalloidin荧光染色观察足细胞的形态和F-肌动蛋白纤维的变化,并提取足细胞RNA。(2)尾静脉注射阿霉素7.5mg/kg制备大鼠肾病模型,实验第5周始予长春新碱0.2mg/kg Biw尾静脉注射治疗肾病大鼠,同期用地塞米松1.8mg/(kg·d)腹腔注射治疗阿霉素肾病大鼠作为治疗对照组,共治疗4周,检测大鼠24小时尿蛋白和血清白蛋白、胆固醇水平,留取大鼠肾脏标本做光镜及电镜检查,提取肾皮质RNA和蛋白。(3)尾静脉注射阿霉素10mg/kg制备小鼠肾病模型,实验第5周始予长春新碱0.45mg/kg Biw尾静脉注射治疗肾病小鼠,同期用地塞米松1.35mg/(kg·d)腹腔注射治疗阿霉素肾病小鼠作为治疗对照组,共治疗4周,检测小鼠24小时尿蛋白和血清白蛋白水平,提取肾皮质RNA。(4)通过RT-PCR分析长春新碱对阿霉素损伤足细胞和阿霉素肾病模型的足突各部位膜蛋白mRNA表达的影响,并通过Western blot分析长春新碱对阿霉素肾病大鼠肾脏粘着斑激酶(FAK)及其磷酸化蛋白表达的影响。结果(1)长春新碱可以挽救阿霉素诱导的足细胞损伤,使足细胞的形态和F-肌动蛋白纤维排列和数量恢复正常。(2)长春新碱可以治疗大鼠阿霉素肾病模型,使其尿蛋白排出减少,血清白蛋白和胆固醇水平恢复正常,融合的足突重现,且比地塞米松治疗起效更快。(3)小鼠阿霉素肾病模型存在蛋白尿自行缓解倾向,但血清白蛋白水平未能恢复。(4)长春新碱可以抑制阿霉素损伤引起小鼠足细胞、大鼠和小鼠肾脏的FAK和α3β1-integrin mRNA的表达增加,使其恢复至正常水平;长春新碱并不能影响因阿霉素引起的足细胞和小鼠肾脏Nephrin mRNA表达的变化,但可以抑制阿霉素引起的大鼠肾脏Podocin mRNA的表达增加,使其恢复至正常水平;长春新碱可以抑制阿霉素引起的大鼠肾脏podocalyxin的表达增加,并且使其恢复至正常水平;长春新碱可以抑制阿霉素引起的足细胞synaptopodin mRNA的表达增加,使其恢复至正常水平,但在阿霉素动物模型中没能得到明确的结果;长春新碱治疗对小鼠足细胞、大鼠和小鼠肾脏α-actinin-4 mRNA的表达影响不大。Western blot分析显示,长春新碱可以抑制阿霉素引起的足细胞pho-FAK的表达增高,使其降至正常水平;长春新碱治疗可以抑制大鼠阿霉素肾病模型的FAK蛋白表达增加,使其恢复至正常水平。结论(1)长春新碱可以挽救阿霉素诱导的足细胞损伤,使足细胞的形态和F-肌动蛋白纤维的排列和数量恢复正常。(2)长春新碱可治疗大鼠阿霉素肾病模型,使其尿蛋白排出减少,血清白蛋白和胆固醇水平恢复正常,融合的足突重现,且比地塞米松治疗起效更快。(3)小鼠阿霉素肾病模型存在蛋白尿自行缓解倾向。(4)长春新碱治疗阿霉素肾病的作用机制可能是:长春新碱治疗抑制了阿霉素引起的足突基底膜侧蛋白FAK和α3β1-integrin的表达,从而维持了足突肌动蛋白细胞骨架的稳定,防止足突融合的发生。