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背景与目的:心脏骤停（Cardiac Arrest,CA）是临床最危急的病症,其患者由于复苏后心肌功能障碍（Post-Rsuscitation Myocardial Dysfunction,PRMD）,幸存者并不多。PRMD的主要机制是缺血再灌注损伤,我们使用缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型来进行研究。研究发现心肺复苏（Cardiopulmonary Resusciation,PCR）过程中使用肾上腺素后心率升高,伊伐布雷定（Ivabradine,IVA）与β受体阻滞剂相比具有降低心率且副作用较小的优点。越来越多的证据表明,IVA在心血管疾病中具有良好的应用前景。先前的研究发现,IVA可以改善CA猪模型的心脏功能障碍。在细胞水平上,IVA在维持线粒体结构的完整性,调节H/R模型中的能量代谢和氧化应激方面均起到保护作用。但是,我们对其调节机制的了解依然十分有限,有关IVA自噬方面的研究还很少。自噬是一种代谢过程,在细胞中广泛分布以维持稳定的内部状态,而PI3K/Akt/mTOR信号传导途径是重要的自噬抑制通路。我们已经进行了几组实验,探究自噬是否参与了IVA对心肌缺血/再灌注损伤（Myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）的保护及其潜在机制。方法:将对数生长期的H9c2细胞随机分为6组:CON组（空白对照组）、H/R组（缺氧复氧组）、H/R+IVA20μM组（IVA20μM处理组）、H/R+IVA100μM组（IVA100μM处理组）、H/R+IVA20μM+Ly294002组（IVA20μM抑制剂组）、H/R+IVA20μM+Ly294002组（IVA100μM抑制剂组）。CON组细胞在完全培养基中常规培养;H/R组细胞进行12h缺氧和24h复氧处理;H/R+IVA20μM组和H/R+IVA100μM组细胞在H/R损伤前分别在含20μmol/L和100μmol/L IVA的完全培养基中孵育12h;H/R+IVA20μM+Ly294002组和H/R+IVA100μM+Ly294002组细胞在H/R损伤前12h分别置于含20μmol/L和100μmol/L IVA的完全培养基中孵育,同时进行10μmol/L的PI3K/Akt通路抑制剂Ly294002孵育。各组细胞进行相应的处理完毕后,采用CCK-8法检测细胞存活率、SOD和MDA试剂盒检测细胞内氧化应激损伤程度、流式细胞术检测细胞凋亡、透射电镜下观察细胞内部自噬和凋亡情况、Western blot法测定PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白和自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的表达情况。结果:1.IVA对H/R诱导的H9c2细胞损伤的影响:与对照组相比,H9c2细胞进行H/R模型处理后,CCK-8结果显示细胞活力显著降低（P<0.05）,SOD含量降低,而MDA含量明显升高（P<0.05）。在H/R的情况下,用IVA处理可显著提高细胞的存活率（P<0.05）。此外,IVA抑制了在H/R条件下,细胞中SOD的减少和MDA的增加（P<0.05）。流式细胞术结果显示,H/R引起的细胞凋亡率明显高于对照组（P<0.05）。然而,用IVA处理后,H/R诱导的细胞凋亡显著减少（P<0.05）。同时,IVA抑制了H/R损伤诱导的H9c2细胞凋亡相关蛋白Casepase-3的增加（P<0.05）。2.IVA对细胞中自噬相关蛋白表达的影响:与对照组相比,H/R导致细胞过度自噬。在H/R损伤条件下,用IVA处理的心肌细胞表达Beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白均显着降低（P<0.05）。3.IVA对H/R诱导的H9c2细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响:Western blot结果显示,与对照组相比,H/R组p-Akt/Akt比值显著降低,加入IVA后p-Akt/Akt比值升高（P<0.05）。然而,与H/R+IVA20μM组和H/R+IVA100μM组相比,使用PI3K/Akt抑制剂（Ly294002）后,p-Akt/Akt的比例显著降低（P<0.05）。4.IVA通过PI3K/Akt途径对H/R诱导的心肌细胞损伤的影响:为了证实这些对心肌细胞的发现,结果显示,在加入Ly294002后,H/R+IVA20μM组和H/R+IVA100μM组的细胞活力和SOD产生量均明显降低（P<0.05）,细胞凋亡明显增加（P<0.05）。5.IVA通过PI3K/Akt/mTOR途径对自噬的影响:为了进一步探讨IVA是否通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制自噬,我们对自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和mTOR进行了检测。与H/R组相比,IVA处理后LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达显著降低（P<0.05）,p-mTOR/mTOR的比例显著增加（P<0.05）。在Ly294002干预下,IVA在蛋白表达水平上对自噬的影响被消除（P<0.05）。此外,透射电子显微镜下观察自噬体时发现,IVA抑制H9c2细胞中自噬体的积累,使用Ly294002阻断了IVA的作用。结论:1.H9c2心肌细胞H/R后会在自噬和凋亡两方面均产生了一定的变化。2.IVA可以通过调节H/R损伤后的心肌细胞自噬,减少氧化应激,增加细胞活力,减少细胞凋亡,进而保护了H9c2细胞。3.IVA可以增加H/R后心肌细胞中与PI3K/Akt/mTOR通路相关的蛋白质的表达和自噬体的产生,并且其作用被Ly294002所逆转,这表明IVA具有调节自噬的作用。4.IVA可减少H/R损伤后心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,减少MDA并增加细胞内SOD水平,其作用能被Ly294002所逆转,表明IVA具通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节氧化应激,减少心肌细胞的凋亡。总之,我们证明了IVA通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制自噬,并在CPR后在心肌细胞损伤中发挥重要作用。