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志贺菌是肠道致病菌,感染后可以引起成年人和儿童腹泻。以前人们一直认为志贺菌不能使畜禽致病,实际上,大量国内外相关报道显示志贺菌可以感染多种动物,例如猪、狐狸、猕猴、牛、鸡、鸭等,感染后可引起腹泻、腹痛严重者甚至导致死亡。近年来发现的鸡志贺菌病是一种急性传染病,可以引起不同日龄和不同品种的鸡发生腹泻,具有十分广泛的流行性,不仅严重危害养禽业健康发展,而且给养禽业带来了巨大经济的损失。因为志贺菌在人和多种动物之间可能存在十分广泛的交叉感染,这严重危害了人类公共卫生和兽医公共卫生。志贺菌侵袭肠上皮细胞是志贺菌致病的关键。大量研究显示,志贺菌侵袭肠道过程中毒力大质粒上Ⅲ型分泌系统分泌的IpaC蛋白通过介导细胞骨架重排而使志贺菌趁机侵入肠上皮细胞,而且只有重组纯化的IpaC蛋白才能够在一定程度上恢复志贺菌的侵袭能力。在分子水平上,IpaC蛋白不同结构域具有不同生物学功能,IpaC蛋白N端的20个氨基酸与Ⅲ型分泌系统有关,中央疏水区两个横跨膜的螺旋线与磷脂膜渗透及蛋白质的稳定有关,而IpaC蛋白C端则与触发肌动蛋白有关。鸡源志贺菌与人源志贺菌分泌的IpaC蛋白分子相同,分析其分子进化特性发现,这两种不同物种来源的志贺菌IpaC蛋白进化起源相同。因此,通过酵母表达系统表达鸡源志贺菌IpaC蛋白,保持IpaC蛋白的天然构象具有十分重要的意义。本研究分别以鸡源志贺菌IpaC基因原序列及根据酵母偏爱性密码子优化合成的IpaC*基因为研究对象,分别构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC*,转化至酵母宿主菌X-33中成功实现了鸡源志贺菌IpaC*基因在毕赤酵母中的胞内表达。研究结果如下:1.根据真核表达载体pGAPZαA多克隆位点及鸡源志贺菌IpaC基因序列设计一对引物,以本实验室保存重组载体pET32a-IpaC为模板,利用PCR技术扩增得到鸡源志贺菌IpaC基因,与真核表达载体pGAPZαA同时双酶切,然后转化至大肠杆菌TOP10中,经菌液PCR、质粒双酶切及测序鉴定,成功构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC。2.真核表达载体pGAPZαA-IpaC经单酶切线性化后,电击法转化至酵母宿主菌X-33中,挑取高抗性(Zeocin浓度为2000 ug/mL)YPD固体培养基的阳性克隆扩大培养,经酵母基因组PCR扩增及序列测定鉴定正确后,挑取鉴定正确的重组酵母pGAPZαA-IpaC/X-33转接至YPD液体培养基中表达,分别在不同时间点定时取样,SDS-PAGE电泳及Western blot检测,结果显示,鸡源志贺菌IpaC基因原序列在重组酵母X-33胞内和胞外均未表达。3.在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下根据毕赤酵母密码子偏好性优化合成鸡源志贺菌IpaC*基因,将其克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,转化至大肠杆菌TOP10中,挑取鉴定正确的重组质粒pGAPZαA-IpaC*转化至酵母宿主菌X-33中,经高抗筛选、PCR扩增及序列测定鉴定正确。挑取鉴定正确的克隆菌株转接于YPD液体培养基中,不同时间点取样,经SDS-PAGE电泳结果显示,经超滤浓缩后培养基上清中无明显条带,菌体沉淀在70 kDa有条带。用表达产物分别与IpaC蛋白的免疫抗体血清、鸡源志贺菌菌体灭活疫苗免疫抗体血清和His标签抗体做Western blot检测,均在70 kDa处有特异性条带,表明优化合成的IpaC*基因在酵母中成功表达,说明酵母表达系统表达外源蛋白水平与外源基因本身有关。本研究中表达的重组目的蛋白大小约为70 kDa,在108h表达量达到最大,为酵母胞内表达。