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目的
基于代谢组学与血液参数探讨妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus， GDM)的高危风险因素，筛选GDM相关的差异代谢物质。评估差异代谢产物和血液参数作为GDM新生物标志物的诊断潜力，为GDM的早期预测提供研究基础。
方法
第一部分：妊娠期糖尿病孕妇血液参数的前瞻性队列研究。随机选择2011年11月至2013年11月间，在广州市妇女儿童医疗中心进行常规产检及分娩的1052例妊娠妇女作为研究对象。收集队列妊娠妇女的血液检查信息，分析不同孕期GDM的危险因素差异，建立联合多因素的GDM风险预测模型。
第二部分：妊娠期糖尿病代谢组学研究。收集2014年11月至2016年1月来院产检及分娩的孕妇血清样本。采用1:1巢式病例对照研究，随机选择30例GDM孕妇，为每例GDM孕妇按匹配原则选取一名正常健康孕妇。应用非靶向液相色谱-质谱联用技术检测代谢物质，采用主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析方法进行统计分析，应用KEGG、HMDB、MetaboAnalyst等生物信息学在线数据库对差异代谢物质进行筛选和富集分析，筛选GDM的代谢轮廓谱及相关的差异代谢物质，并寻找相关代谢途径。结合代谢组学筛选的差异代谢物质及血液参数的差异指标进行回归分析，建立GDM的联合预测方程，并应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价方程的诊断效能。
结果：
第一部分：妊娠期糖尿病孕妇血液参数的前瞻性队列研究
1.共1052例妊娠妇女纳入研究，其中GDM孕妇159例(15.1％)，非GDM孕妇893例(84.9％)。
2.研究对象的一般情况分析：队列内GDM孕妇年龄范围为23至41岁，平均年龄为29.92±3.23岁，正常健康孕妇年龄范围为19至43岁，平均年龄为28.62±3.37岁，差异具有统计学意义(P＜0.05)。GDM孕妇妊娠年龄30-34岁(RR=3.39，95％CI：1.54-10.21，P＜0.05)，妊娠年龄35岁以上(RR=3.75，95％CI：1.52-13.24，P＜0.05)，有糖尿病家族史(RR=1.66，95％CI：1.15-3.01，P＜0.05)，均为GDM的危险因素。
3.不同孕期血液参数的混合效应模型分析：结果表明，GDM孕妇与正常健康孕妇的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)浓度、血小板计数(PLT)、血小板分布宽度(PDW)和平均血小板体积(MPV)水平，在时间效应(不同孕期)上差异具有统计学意义(P＜0.05)，RBC、PDW、HGB及PLT水平随孕期增加逐渐下降，而MPV水平则上升；PDW、RBC在组别效应上差异具有统计学意义(P＜0.05)，GDM孕妇的PDW和RBC水平比正常健康孕妇高；HGB在时间(孕期)效应和组别效应具有相乘模型交互协同作用(P＜0.05)。
4.GDM影响因素的多因素Logistic回归分析：结果表明，有糖尿病家族史(RR=1.80，95％CI：1.07-3.01，P=0.03)，年龄(RR=1.11，95％CI：1.05-1.16，P=0.01)，孕早期RBC(RR=6.63，95％CI：3.53-12.44，P=0.01)和孕早期PDW(RR=1.12，95％CI：1.01-1.25，P=0.03)，都会增加孕妇GDM发生的风险。
5.GDM风险预测模型的ROC曲线分析：结果表明，孕早期RBC、孕早期PDW、糖化血红蛋白及年龄作为独立因子分别预测GDM的曲线下面积为0.673(95%CI：0.621-0.723)、0.590(95%CI：0.536-0.643)、0.721(95%CI：0.633-0.798)、0.614(95%CI：0.584-0.644)。联合预测因子PRE1(孕早期RBC+孕早期PDW)预测GDM的曲线下面积为0.667(95% CI：0.613-0.718)；PRE2(年龄+孕早期RBC+孕早期PDW)预测GDM的曲线下面积为0.693(95% CI：0.664-0.720)。PRE3(年龄+糖尿病家族史+糖化血红蛋白)预测GDM的曲线下面积为0.729(95%CI：0.641-0.805)。
第二部分：妊娠期糖尿病代谢组学研究
1.GDM孕妇与正常健康孕妇外周血清代谢组学分析：结果表明，两组在完整孕期(包含孕早、中、晚期)共筛选出28种差异代谢物质，其中，孕早期17种、孕中期5种、孕晚期16种。完整孕期分析结果表明，GDM孕妇与正常健康孕妇比较，GDM孕妇血清含量增加的差异代谢物质包括：Sphinganine1-phosphate(1-磷酸鞘磷脂)、Ceramides(N-acylsphingosine，神经酰胺)、Sphingomyelin(鞘磷脂)、Lactosylceramide(乳糖神经酰胺)等鞘脂类代谢物质，以及Hemin(血红素)、Lysophosphatidylcholine(LysoPC，溶血卵磷脂)、Phosphatidicacid(磷脂酸)、Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)、Phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱)及Piperidine(哌啶)等；血清含量下降的差异代谢物质包括：Citicoline(胞二磷胆碱)、Dolichylβ-D-glucosylphosphate(Dolichylβ-D-葡糖基磷酸酯)及7-Methyl-3-oxo-6-octenoyl-CoA(7-甲基-3-氧代-6-辛烯酰基-CoA)。孕早期血清样本代谢组学分析结果表明，GDM孕妇血清中含量增加的差异代谢物质包括：Sphinganine1-phosphate(1-磷酸鞘磷脂)、Ceramides(N-acylsphingosine)(神经酰胺)、Sphingomyelin(鞘磷脂)及Lactosylceramide(乳糖神经酰胺)等鞘脂类代谢物质，Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)、Phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱)等甘油磷脂代谢物质，以及Diglyceride(甘油二脂)、Hemin(血红素)等物质。孕中期血清样本代谢组学分析结果表明，GDM孕妇血清中含量增加的差异代谢物质包括：Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)、OPC4-CoA、Triglycerides(甘油三酯)、3-Hydroxy-3-(4-methylpent-3-en-1-yl)glutaryl-CoA(3-羟基-3-(4-甲基戊-3-烯-1-基)戊二酰基-CoA)；血清中含量下降的差异代谢物质有Myo-inositolhexakisphosphate(肌醇六磷酸盐)。孕晚期血清样本代谢组学分析结果表明，GDM孕妇血清中含量增加的差异代谢物质包括：Sphinganine1-phosphate(1-磷酸鞘磷脂)、Diglyceride(甘油二脂)、Phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱)、Triglycerides(甘油三酯)及Hyaluronan(透明质酸)等。
2.GDM孕妇不同孕期差异代谢物质的最小二乘判别分析法(PLS-DA)的排序验证结果表明，完整孕期和孕早期的代谢组学分析拟合程度较好。差异代谢物质富集分析结果显示，Sphingolipidmetabolism(鞘脂代谢途径)及Glyceropho-spholipidmetabolism(甘油磷脂代谢途径)是完整孕期及孕早期GDM主要差异性代谢途径。将完整孕期中归属上述通路的代谢物质进行条件Logistic回归分析。结果表明，Sphinganine-1-phosphate(1-磷酸鞘氨醇，S1P)、Ceramides(d18:1/24:1(15Z))(神经酰胺，Cer)、Phosphatidylethanolamine(24:1(15Z)/22:0)(磷脂酰乙醇胺，PE)进入方程。将上述3个因素联合建立新的联合预测因子：X*Beta1(S1P+Cer+PE)=0.16S1P+0.01Cer+0.02PE。同时，结合血液参数结果，将孕早期PDW及孕早期RBC及3个差异代谢物质建立新的联合预测因子X*Beta2(S1P+Cer+PE+孕早期RBC+孕早期PDW)=0.14S1P+0.01Cer+0.02PE+1.45RBC+0.001PDW。ROC曲线分析结果表明，X*Beta1(S1P+Cer+PE)预测GDM的曲线下面积为0.848(95% CI：0.732-0.927)，预测GDM发生的灵敏度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为93.33%、63.33%、2.55和0.11；X*Beta2(S1P+Cer+PE+孕早期RBC+孕早期PDW)预测GDM的曲线下面积为0.861(95% CI：0.747-0.937)，预测GDM发生的灵敏度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为83.33%、76.67%、3.57和0.22。
结论
1.进一步证实GDM的一些已知危险因素，如糖尿病的家族遗传史、高龄妊娠。
2.孕早期红细胞计数(RBC)和血小板分布宽度(PDW)偏高可作为GDM早期诊断的相关参考指标。
3.Sphingolipidmetabolism(鞘脂代谢途径)及Glycerophospholipidmetabolism(甘油磷脂代谢途径)是GDM的主要差异代谢通路。
4.GDM孕妇与正常健康孕妇比较，完整孕期表达上升的差异代谢物质包括：1-磷酸鞘磷脂、神经酰胺、鞘磷脂、乳糖神经酰胺、溶血卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰胆碱；表达下降的差异代谢物质包括：胞二磷胆碱、Dolichylβ-D-葡糖基磷酸酯及7-甲基-3-氧代-6-辛烯酰基-CoA。孕早期的差异代谢物质中，表达上升的包括：1-磷酸鞘磷脂、神经酰胺、鞘磷脂、乳糖神经酰胺及甘油二脂等。孕中期表达上升的差异代谢物质包括：磷脂酰乙醇胺、OPC4-CoA及甘油三酯等；表达下降的差异代谢物质有肌醇六磷酸盐。孕晚期表达上升的差异代谢物质包括1-磷酸鞘磷脂、甘油二脂、磷脂酰胆碱、甘油三酯及透明质酸等。
5.联合血清神经酰胺、1-磷酸鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺建立风险预测模型，对GDM具有较好的预测价值。
基于代谢组学与血液参数探讨妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus， GDM)的高危风险因素，筛选GDM相关的差异代谢物质。评估差异代谢产物和血液参数作为GDM新生物标志物的诊断潜力，为GDM的早期预测提供研究基础。
方法
第一部分：妊娠期糖尿病孕妇血液参数的前瞻性队列研究。随机选择2011年11月至2013年11月间，在广州市妇女儿童医疗中心进行常规产检及分娩的1052例妊娠妇女作为研究对象。收集队列妊娠妇女的血液检查信息，分析不同孕期GDM的危险因素差异，建立联合多因素的GDM风险预测模型。
第二部分：妊娠期糖尿病代谢组学研究。收集2014年11月至2016年1月来院产检及分娩的孕妇血清样本。采用1:1巢式病例对照研究，随机选择30例GDM孕妇，为每例GDM孕妇按匹配原则选取一名正常健康孕妇。应用非靶向液相色谱-质谱联用技术检测代谢物质，采用主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析方法进行统计分析，应用KEGG、HMDB、MetaboAnalyst等生物信息学在线数据库对差异代谢物质进行筛选和富集分析，筛选GDM的代谢轮廓谱及相关的差异代谢物质，并寻找相关代谢途径。结合代谢组学筛选的差异代谢物质及血液参数的差异指标进行回归分析，建立GDM的联合预测方程，并应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价方程的诊断效能。
结果：
第一部分：妊娠期糖尿病孕妇血液参数的前瞻性队列研究
1.共1052例妊娠妇女纳入研究，其中GDM孕妇159例(15.1％)，非GDM孕妇893例(84.9％)。
2.研究对象的一般情况分析：队列内GDM孕妇年龄范围为23至41岁，平均年龄为29.92±3.23岁，正常健康孕妇年龄范围为19至43岁，平均年龄为28.62±3.37岁，差异具有统计学意义(P＜0.05)。GDM孕妇妊娠年龄30-34岁(RR=3.39，95％CI：1.54-10.21，P＜0.05)，妊娠年龄35岁以上(RR=3.75，95％CI：1.52-13.24，P＜0.05)，有糖尿病家族史(RR=1.66，95％CI：1.15-3.01，P＜0.05)，均为GDM的危险因素。
3.不同孕期血液参数的混合效应模型分析：结果表明，GDM孕妇与正常健康孕妇的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)浓度、血小板计数(PLT)、血小板分布宽度(PDW)和平均血小板体积(MPV)水平，在时间效应(不同孕期)上差异具有统计学意义(P＜0.05)，RBC、PDW、HGB及PLT水平随孕期增加逐渐下降，而MPV水平则上升；PDW、RBC在组别效应上差异具有统计学意义(P＜0.05)，GDM孕妇的PDW和RBC水平比正常健康孕妇高；HGB在时间(孕期)效应和组别效应具有相乘模型交互协同作用(P＜0.05)。
4.GDM影响因素的多因素Logistic回归分析：结果表明，有糖尿病家族史(RR=1.80，95％CI：1.07-3.01，P=0.03)，年龄(RR=1.11，95％CI：1.05-1.16，P=0.01)，孕早期RBC(RR=6.63，95％CI：3.53-12.44，P=0.01)和孕早期PDW(RR=1.12，95％CI：1.01-1.25，P=0.03)，都会增加孕妇GDM发生的风险。
5.GDM风险预测模型的ROC曲线分析：结果表明，孕早期RBC、孕早期PDW、糖化血红蛋白及年龄作为独立因子分别预测GDM的曲线下面积为0.673(95%CI：0.621-0.723)、0.590(95%CI：0.536-0.643)、0.721(95%CI：0.633-0.798)、0.614(95%CI：0.584-0.644)。联合预测因子PRE1(孕早期RBC+孕早期PDW)预测GDM的曲线下面积为0.667(95% CI：0.613-0.718)；PRE2(年龄+孕早期RBC+孕早期PDW)预测GDM的曲线下面积为0.693(95% CI：0.664-0.720)。PRE3(年龄+糖尿病家族史+糖化血红蛋白)预测GDM的曲线下面积为0.729(95%CI：0.641-0.805)。
第二部分：妊娠期糖尿病代谢组学研究
1.GDM孕妇与正常健康孕妇外周血清代谢组学分析：结果表明，两组在完整孕期(包含孕早、中、晚期)共筛选出28种差异代谢物质，其中，孕早期17种、孕中期5种、孕晚期16种。完整孕期分析结果表明，GDM孕妇与正常健康孕妇比较，GDM孕妇血清含量增加的差异代谢物质包括：Sphinganine1-phosphate(1-磷酸鞘磷脂)、Ceramides(N-acylsphingosine，神经酰胺)、Sphingomyelin(鞘磷脂)、Lactosylceramide(乳糖神经酰胺)等鞘脂类代谢物质，以及Hemin(血红素)、Lysophosphatidylcholine(LysoPC，溶血卵磷脂)、Phosphatidicacid(磷脂酸)、Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)、Phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱)及Piperidine(哌啶)等；血清含量下降的差异代谢物质包括：Citicoline(胞二磷胆碱)、Dolichylβ-D-glucosylphosphate(Dolichylβ-D-葡糖基磷酸酯)及7-Methyl-3-oxo-6-octenoyl-CoA(7-甲基-3-氧代-6-辛烯酰基-CoA)。孕早期血清样本代谢组学分析结果表明，GDM孕妇血清中含量增加的差异代谢物质包括：Sphinganine1-phosphate(1-磷酸鞘磷脂)、Ceramides(N-acylsphingosine)(神经酰胺)、Sphingomyelin(鞘磷脂)及Lactosylceramide(乳糖神经酰胺)等鞘脂类代谢物质，Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)、Phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱)等甘油磷脂代谢物质，以及Diglyceride(甘油二脂)、Hemin(血红素)等物质。孕中期血清样本代谢组学分析结果表明，GDM孕妇血清中含量增加的差异代谢物质包括：Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)、OPC4-CoA、Triglycerides(甘油三酯)、3-Hydroxy-3-(4-methylpent-3-en-1-yl)glutaryl-CoA(3-羟基-3-(4-甲基戊-3-烯-1-基)戊二酰基-CoA)；血清中含量下降的差异代谢物质有Myo-inositolhexakisphosphate(肌醇六磷酸盐)。孕晚期血清样本代谢组学分析结果表明，GDM孕妇血清中含量增加的差异代谢物质包括：Sphinganine1-phosphate(1-磷酸鞘磷脂)、Diglyceride(甘油二脂)、Phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱)、Triglycerides(甘油三酯)及Hyaluronan(透明质酸)等。
2.GDM孕妇不同孕期差异代谢物质的最小二乘判别分析法(PLS-DA)的排序验证结果表明，完整孕期和孕早期的代谢组学分析拟合程度较好。差异代谢物质富集分析结果显示，Sphingolipidmetabolism(鞘脂代谢途径)及Glyceropho-spholipidmetabolism(甘油磷脂代谢途径)是完整孕期及孕早期GDM主要差异性代谢途径。将完整孕期中归属上述通路的代谢物质进行条件Logistic回归分析。结果表明，Sphinganine-1-phosphate(1-磷酸鞘氨醇，S1P)、Ceramides(d18:1/24:1(15Z))(神经酰胺，Cer)、Phosphatidylethanolamine(24:1(15Z)/22:0)(磷脂酰乙醇胺，PE)进入方程。将上述3个因素联合建立新的联合预测因子：X*Beta1(S1P+Cer+PE)=0.16S1P+0.01Cer+0.02PE。同时，结合血液参数结果，将孕早期PDW及孕早期RBC及3个差异代谢物质建立新的联合预测因子X*Beta2(S1P+Cer+PE+孕早期RBC+孕早期PDW)=0.14S1P+0.01Cer+0.02PE+1.45RBC+0.001PDW。ROC曲线分析结果表明，X*Beta1(S1P+Cer+PE)预测GDM的曲线下面积为0.848(95% CI：0.732-0.927)，预测GDM发生的灵敏度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为93.33%、63.33%、2.55和0.11；X*Beta2(S1P+Cer+PE+孕早期RBC+孕早期PDW)预测GDM的曲线下面积为0.861(95% CI：0.747-0.937)，预测GDM发生的灵敏度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为83.33%、76.67%、3.57和0.22。
结论
1.进一步证实GDM的一些已知危险因素，如糖尿病的家族遗传史、高龄妊娠。
2.孕早期红细胞计数(RBC)和血小板分布宽度(PDW)偏高可作为GDM早期诊断的相关参考指标。
3.Sphingolipidmetabolism(鞘脂代谢途径)及Glycerophospholipidmetabolism(甘油磷脂代谢途径)是GDM的主要差异代谢通路。
4.GDM孕妇与正常健康孕妇比较，完整孕期表达上升的差异代谢物质包括：1-磷酸鞘磷脂、神经酰胺、鞘磷脂、乳糖神经酰胺、溶血卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰胆碱；表达下降的差异代谢物质包括：胞二磷胆碱、Dolichylβ-D-葡糖基磷酸酯及7-甲基-3-氧代-6-辛烯酰基-CoA。孕早期的差异代谢物质中，表达上升的包括：1-磷酸鞘磷脂、神经酰胺、鞘磷脂、乳糖神经酰胺及甘油二脂等。孕中期表达上升的差异代谢物质包括：磷脂酰乙醇胺、OPC4-CoA及甘油三酯等；表达下降的差异代谢物质有肌醇六磷酸盐。孕晚期表达上升的差异代谢物质包括1-磷酸鞘磷脂、甘油二脂、磷脂酰胆碱、甘油三酯及透明质酸等。
5.联合血清神经酰胺、1-磷酸鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺建立风险预测模型，对GDM具有较好的预测价值。