论文部分内容阅读
实验目的： 本研究的目的有三:1、在实验室已有工作基础上，进一步完善小鼠胰腺腺泡细胞钙振荡（Pancreatic Acinar Cell Calcium Oscillations, PACCOs）的激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）成像研究方法,对PACCOs进行较系统的观测；2、构建小鼠胰腺腺泡细胞的急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）模型和小鼠的AP整体动物模型,分别观测其 PACCOs的特点；3、以此为基础,探讨大麻素受体激动剂GW405833（GW）对小鼠PACCOs和AP模型的影响。 实验方法： 1.小鼠胰腺腺泡细胞的急性分离:选用4~6个月（40~60 g）的昆明小鼠，经麻醉、颈椎脱臼处死后迅速取其胰腺，以胶原酶消化的方法获取胰腺腺泡细胞悬液。 2. PACCOs的LSCM成像记录:取适量胰腺腺泡细胞悬液于标本槽中，待细胞贴壁后，避光负载钙荧光染料Fluo-4-AM，以乙酰胆碱（ACh）诱导胰腺腺泡细胞产生钙振荡；相关药物的影响根据实验方案的要求适时通过灌流系统给予；以连续二维扫描的方式（XYT）进行LSCM成像记录；扫描记录覆盖加药前、加药中和药物冲洗后的全过程。实验在室温下进行。 3.小鼠整体和离体AP模型的制备和测试：（1）整体模型：取4~6个月的昆明小鼠，按体重分两次（间隔1 h）腹腔注射左旋精氨酸（L-Arg,4 g/kg）制备AP动物模型，分别在第二次注射后的24 h，采集血样、右肺和胰尾组织分别用于测试血清淀粉酶（AMS）、肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性和胰腺组织病理切片,急性分离的胰腺腺泡细胞则用于钙振荡的成像记录。GW（10 mg/kg）(在有需要的情况下)则在建模前0.5h按体重腹腔注射。（2）离体模型：在急性分离的细胞中按不同方案直接加入L-Arg，对其钙振荡进行LSCM成像观察。 4.数据的分析处理：综合应用 Olympus Fluoview（共聚焦显微镜自带的软件）、ImageJ（美国NIH开发的免费图像软件）和Excel VBA编程的方法实现对图像数据的有效处理和统计分析。反映钙振荡特点的主要参数是平均钙释放量。实验设计以自身对照为主，多组间数据比较采用方差分析，P＜0.05认为有统计学意义。 实验结果和结论： 1.成年小鼠PACCOs的LSCM成像研究：采用LSCM的XYT扫描方式可直观而方便地记录到ACh诱发的急性分离的小鼠PACCOs，该反应可被毒蕈碱型受体（M受体）阻断剂阿托品完全阻断。以此为基础，本研究进一步优化了灌流系统，提高了动物的选用标准，通过剂量效应确定了ACh的常用浓度为100 nM；在此基础上，观察比较了同一视野下不同细胞以及同一细胞内不同部位的钙振荡特点，以期更全面认识胰腺腺泡细胞钙振荡；尽可能采用两段式的自身对照实验设计方法，以期避开激光照射损伤和染料毒性的影响，使PACCOs的成像研究更可靠。 2. L-Arg和GW对急性分离胰腺腺泡细胞钙振荡的影响：与对照组相比，一定时间（5~10 min）的L-Arg10 mM孵育可使PACCO的平均钙释放强度增大（n5 min=103, P≤0.05；n10 min=136, P＜0.01）；但孵育20 min后则使其减弱（n=80, P＜0.05），这与AP时腺泡细胞胞内钙信号的变化情况类似。GW则对PACCOs有明显的抑制作用（nGW50μM=99, P＜0.01；nGW100μM=66, P＜0.01）。用GW与L-Arg共同孵育细胞时，发现GW可逆转L-Arg孵育造成的PACCOs平均钙释放量的增高，使PACCOs的平均钙释放量恢复到对照组的水平（n=108, P＜0.01）。 3. AP动物模型的研究：在用腹腔大剂量注射两次L-Arg（4 g/kg），两次间隔1 h的方法诱导的AP模型中，24 h内动物死亡率约为60％，PACCOs的平均钙释放量在24 h时明显增强（约增强25.76%， n=80, P＜0.01），48 h时则减弱（约降低13.04%，n=124, P＜0.05）；预先用GW处理动物后再造模，24 h内动物死亡率约为40%， AP24 h时 PACCO的平均钙释放量恢复到了对照组的水平（n=177, P＞0.05）。AP时，血清AMS和肺组织MPO活性在24 h时显著升高（nAMS=4, P<0.05,升高63.5%；nMPO=3, P<0.05,升高25.2%），胰腺组织发生轻微病理改变；而预先用GW处理动物后再造模，血清 AMS和肺组织 MPO活性与对照组的差异均无统计学意义（nAMS=3, P＞0.05；nMPO=3, P＞0.05），胰腺组织也有轻微病理改变。以上结果提示：GW预处理降低了动物的死亡率，减轻了AP24 h的病情，对AP具有一定的保护作用。