论文部分内容阅读
研究背景B细胞是免疫系统的重要组成部分,其主要功能为产生抗体、介导体液免疫应答,同时还具备提呈抗原、分泌细胞因子的功能。长期以来,基于对B细胞经典作用的认识,人们一方面将其视为机体抵抗病原入侵并保持稳态的主要的免疫效应细胞,另一方面又将其异常活化视为多种免疫相关疾病(特别是自身免疫病)的关键致病因素。然而,在过去的二十多年中,人们逐渐发现一部分B细胞具有免疫负调控作用且对维持机体免疫平衡具有重要意义,根据其功能特征人们将这部分细胞称之为调节性B细胞(Breg, regulatory B cells)。虽然大量的工作都已经证实了Breg的存在,但人们对其表面标志物和表型的界定并未达成一致观点。在Breg具体的研究工作中,白细胞介素-10(IL-10,interleukin-10)的表达水平常被作为公认指标以对Breg进行分析甚至分离。而在目前已发现的Breg的几种功能相关分子中,IL-10是Breg发挥调节功能的关键分子,对其研究也最为广泛深入。一方面,体内外的实验均表明IL-10缺失的Breg无法正常行使调节功能；另一方面,多项研究表明B细胞特异性的IL-10缺失会引发多种免疫相关疾病并与多种病理损伤相关。由于IL-10的表达与Breg的调节功能的紧密相关,研究B细胞中IL-10产生机制的对于深入认识Breg具有重要的科学意义。IL-10是免疫系统中经典的抑炎因子,是调节机体免疫平衡的重要组分。IL-10可介导包括抑制天然免疫细胞的成熟与活化,抑制炎性细胞因子的分泌,诱导Treg分化等在内的多种免疫效应,同时IL-10信号的缺失会导致多种免疫相关疾病的发生。外源性输入的IL-10蛋白在体内的代谢周期很短,限制了其作为药物的临床应用,而利用内源性的IL-10则能较好地解决这一问题。内源性的IL-10可以来源于多种细胞,但近年来的多项研究表明B细胞是多种生理和病理状态下IL-10的主要来源,而通过过继回输IL-10分泌的Breg细胞可以缓解和治疗多种免疫相关疾病。因此对B细胞中IL-10产生机制的研究具有重要的应用价值。IL-10的表达调控主要发生在转录水平和转录后水平。长期以来,对Breg特异性转录因子的探索一直没有停止但始终没有结果,而已经报道的能够在B细胞中调控IL-10转录的几种转录因子,如NF-kB,Bc16和Blimp1等对B细胞多种其他生物学功能亦有影响,因此目前并没有在B细胞中找到特异性调节IL-10表达的转录因子。对IL-10转录后调控水平的研究表明,IL-10的mRNA的3’非翻译区(3’UTR,3’-untranslated region)具有多个腺嘌呤和尿嘧啶富集序列(ARE, AU-rich element),当RNA结合蛋白或microRNA与之结合后会对IL-10 mRNA的稳定性产生显著影响。因此,IL-10的最终蛋白表达水平会显著地受到转录后调控的影响,但目前对B细胞中IL-10表达的转录后调控研究仍少有报道。我们应用IL-10抗体标记磁珠分选了IL-10表达阳性和IL-10表达阴性的B细胞并通过基因芯片分析寻找IL-10表达相关的转录后调控因子。RBM47是我们筛选到的差异基因之一,其表达产物为一个具有3个RNA识别基序(RNA recognition motif)结构的RNA结合蛋白。已有的研究表明Rbm47可通过转录后调控的方式影响mRNA分子的存在状态并最终影响多种生物学进程,但其对免疫系统的影响并未见报道。通过基因改造和免疫治疗相结合,T细胞、DC细胞、NK细胞及间充质干细胞都已在临床上用于疾病的治疗。Breg由于其独特的免疫抑制功能也引起了人们将其应用于临床治疗的关注,而一些研究也探索了通过基因改造提高Breg免疫抑制效果的可行性,并得到了肯定的结论。由于IL-10是B细胞行使调节功能的关键分子,而IL-10的蛋白和mRNA都具有不稳定性,因此我们假设通过找到并调控IL-10表达相关的转录后调控因子可以促进B细胞的调节性功能,并针对Rbm47这一分子进行了验证。研究目标检测IL-10+B细胞中Rbm47的表达情况；探讨Rbm47对B细胞IL-10产生及免疫抑制作用的影响及潜在机制；加深对Breg免疫调控作用形成机制的认识并为推进其临床应用转化提供理论依据。方法与结果1. 应用IL-10抗体标记的磁珠,我们分选了IL-10分泌阳性和IL-10分泌阴性的B细胞,并应用表达谱芯片技术分析差异表达的转录后调控相关蛋白,RBM47在IL-10分泌阳性的B细胞中表达显著升高。2. 通过应用LPS体外诱导IL-10和及应用IL-10-GFP报告基因小鼠分选IL-10分泌阳性和IL-10分泌阴性细胞,我们对基因芯片的结果进行了验证。结果表明,B细胞中的Rbm47在IL-10诱导过程中表达升高,且特异性表达在IL-10分泌阳性的B细胞中。3.通过干扰慢病毒感染和嘌呤霉素筛选,我们建立了Rbm47敲低的SP2/0细胞系。通过应用qPCR和ELISA对其IL-10表达水平的检测,我们发现与对照组相比Rbm47敲低的SP2/0细胞系中IL-10的mRNA和蛋白表达水平都有显著下降。4.通过双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP,RNA Binding Protein Immunoprecipitation)实验我们检测了Rbm47对IL-10启动子和mRNA的结合水平。结果表明Rbm47可结合IL-10的mRNA而不结合IL-10的启动子。5. 通过应用放线菌素D抑制mRNA合成,并在不同时间点收集mRNA样品以测定IL-10mRNA的衰减速率,我们分析了Rbm47对IL-10mRNA稳定性的影响。结果表明,敲低Rbm47后B细胞中IL-10的降解速率显著加快,而在过表达Rbm47的体系中IL-10的降解速率则被减缓。6.通过应用Rbm47过表达逆转录病毒感染原代B细胞,我们进一步分析了Rbm47对B细胞中IL-10表达的影响。qPCR和FACS的结果都表明Rbm47过表达可以促进B细胞中IL-10的表达。7. 通过流式分选Rbm47表达逆转录病毒感染的B细胞及对照细胞并将其与T淋巴细胞共培养,我们在体外分析了Rbm47对B细胞调节性功能的影响。结果表明,Rbm47过表达可以促进B细胞分泌IL-10并促进Treg的诱导分化。8.通过给IL-10-GFP报告基因小鼠饲喂浓度为3%的DSS进行溃疡性结肠炎(UC,ulcerative colitis)造模,我们检测了其肠系膜淋巴结中IL-10表达阳性B细胞的丰度及肠系膜淋巴结B细胞中IL-10和Rbm47表达水平。结果表明,与正常小鼠相比,UC小鼠肠系膜淋巴结中IL-10分泌B细胞的比例减少,同时其肠系膜淋巴结B细胞中IL-10和Rbm47的表达水平降低。9. 通过过继转移Rbm47表达逆转录病毒感染的B细胞及对照B细胞对DSS诱导UC小鼠进行治疗,我们在体内评价了Rbm47对B细胞调节性功能的影响。结果表明,与对照组相比Rbm47过表达B细胞可减缓UC小鼠体重降低,减轻肠道损伤并增加肠系膜淋巴结中Treg的比例,缓解UC小鼠的疾病的严重程度。结论综上,本研究表明Rbm47通过影响IL-10mRNA稳定性,在转录后水平对B细胞中IL-10的产生起到正调控作用,进而促进了B细胞的调节性功能。同时,我们的结果还表明,调节转录后调控因子是促进B细胞调节性功能的一种的可行方案。本研究拓展了B细胞调节性功能形成机制的认识,也为促进B细胞调节性功能的应用提供了思路和理论基础