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肿瘤抑制因子TSC2(tuberin)是mTOR信号通路上游的负调节因子，具有GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）活性，调节着细胞内DNA的转录和蛋白质的合成；研究表明，TSC2能够作为细胞内的一种汇集多种信号的中心，在调节细胞增殖、分化、凋亡及胚胎发育等生理过程中发挥着重要的作用。然而，目前TSC2基因调控骨骼肌生长发育的分子机制尚不明确。通过研究TSC2基因调控山羊成肌细胞增殖的分子机理，对调控动物骨骼肌生长发育具有重要的理论意义和研究价值。 本研究以分离纯化后的奶山羊骨骼肌成肌细胞为试验材料，克隆获得了山羊TSC2基因的编码区；通过过表达和干扰技术研究TSC2基因对成肌细胞增殖的作用；通过RT-qPCR和Western Blot等方法，分析TSC2基因过表达和干扰后对mTOR信号通路相关基因表达和成肌细胞增殖的影响。该研究获得了如下主要结果： 1.山羊成肌细胞分离与鉴定 以奶山羊羔羊半腱肌组织为试验材料，依次利用I型胶原酶和胰蛋白酶消化肌肉组织，利用差速贴壁法纯化，最终得到成肌细胞。利用RT-PCR和免疫荧光染色法对分离纯化后的成肌细胞进行进一步鉴定。细胞呈梭形，生长状态良好；生肌调节因子MyoD和Myf5基因、成肌细胞特异标志蛋白Desmin呈阳性表达；诱导分化后的成肌细胞能够相互融合形成肌管，成肌特异性标志蛋白MYHC呈阳性表达。表明分离后的成肌细胞可用于后续研究。 2.TSC2基因克隆与生物信息学分析 通过提取山羊成肌细胞总RNA，根据GenBank中收录的山羊(MH643731)的TSC2基因序列设计引物，利用RT-PCR技术克隆得到奶山羊TSC2基因CDS序列，其长度为5250bp，编码1749个氨基酸，蛋白分子量为193.69KDa，主要在细胞质内储存。分析奶山羊的TSC2基因CDS区与其他物种的遗传关系得知其与绵羊亲缘关系最近。 3.过表达TSC2对成肌细胞增殖的研究 成功获得含有目的基因的重组过表达质粒载体pcDNA3.1-TSC2，转染山羊成肌细胞后发现，TSC2基因的mRNA表达量上升18倍增殖相关基因Cyclin E，p27和p57的mRNA和蛋白表达水平受到显著影响；同时，流式细胞结果显示G1期的细胞数目显著增加，S期细胞的数目显著减少，表明过表达TSC2基因能够抑制山羊成肌细胞增殖。同时，过表达TSC2基因显著下调mTOR和p70S6K mRNA与蛋白表达水平，用mTOR激动剂（MYH1485）处理可以减弱TSC2基因过表达对成肌细胞增殖的抑制作用，表明过表达TSC2基因能够通过mTOR信号通路抑制成肌细胞增殖。 4.干扰TSC2对成肌细胞增殖的研究 根据克隆获得的TSC2基因CDS序列，设计特异性的siRNA，转染奶山羊成肌细胞后可使TSC2基因的mRNA表达量显著下调70%，显著影响增殖相关基因Cyclin E，p27和p57mRNA与蛋白表达水平；流式细胞结果显示，G1期的细胞数显著减少，S期的细胞数显著增多，表明干扰TSC2基因促进了山羊成肌细胞增殖。此外，干扰TSC2基因能够显著上调mTOR和p70S6K的mRNA与蛋白表达水平，用mTOR抑制剂（rapamycin）处理可减弱干扰TSC2基因对成肌细胞增殖的促进作用，表明干扰TSC2基因能够通过mTOR信号通路促进成肌细胞增殖。