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目的:本研究旨在对乌天麻热水浸提出的天麻粗多糖进行分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性研究,为天麻多糖的应用奠定理论基础。方法:(1)本文采用水提醇沉法(提取温度为60℃,时间为2 h,提取次数为3次,料液比为1:30,乙醇醇沉浓度为80%)对乌天麻中的多糖进行提取,然后通过Sevage法对天麻多糖进行脱蛋白,中空纤维超滤膜脱除小分子杂质和色素并利用不同分子量的中空纤维超滤膜将多糖进行分段。(2)采用DEAE-52纤维素离子交换柱色谱和Sephadex G-100凝胶柱色谱对分段后的天麻多糖继续进行分离纯化,并采用苯酚-硫酸法对多糖进行跟踪检测,合并组分。(3)采用SEC-MALS-VI-RI技术进行多糖分子量及分子构象的研究,并结合紫外光谱分析多糖的纯度及采用HILIC-ELSD分析多糖的单糖组成,选择符合要求的多糖进行结构表征及抗肿瘤活性研究。(4)采用红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)、扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)等方法研究天麻多糖的一级结构和高级结构。红外光谱表征各组分精制多糖的特征吸收峰,核磁共振技术分析其糖残基类型、连接顺序及取代位点。采用刚果红实验考察天麻多糖糖链的初级螺旋构象,通过扫描电镜观察其表观形态分布并推断出多糖的空间构象,以XRD来检测糖链的规则排布结构,从而获得天麻多糖糖链的高级构象信息。(5)采用MTT法对天麻多糖进行抗肿瘤活性研究,并结合结构表征对多糖结构和活性的相关性进行分析。结果:(1)采用水提醇沉法提取天麻多糖,最终粗多糖的得率为5.47%。对其进行脱蛋白、除小分子、脱色素及采用中空纤维超滤膜分段后得到初步纯化的天麻多糖。(2)分段后的天麻多糖采用DEAE-52纤维素离子交换柱色谱和Sephadex G-100柱层析继续进行分离纯化,最终从天麻中分离得到6部分多糖(WTM-1、WTM-2、WTM-3、WTM-4、WTM-5、WTM-6),采用SEC-MALS-VI-RI技术进行了多糖分子量的测定,并结合紫外光谱分析6部分多糖的纯度。结果可知,WTM-1出现两个峰,大小分子量没有分开,而WTM-2、WTM-3、WTM-5及WTM-6含量均达到98.0%以上,达到结构解析及活性研究的标准,WTM-4含量为87.1%,WTM-2~WTM-6的分子量分别为40.41 KDa、30.43 KDa、151.72 KDa、17.02 KDa、12.76 KDa。(3)利用HILIC-ELSD技术进行多糖的单糖组成分析,结果可知四种精制多糖均是杂多糖(但大多数为葡萄糖,其他单糖含量较少),其单糖组成主要包括:葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖醛酸。利用刚果红溶液、红外光谱、核磁共振技术、扫描电镜及X射线衍射等方法分析天麻多糖的结构,结果表明四种多糖为α-吡喃糖环,以1,4-葡萄糖为主链,侧链分支点在C-6位,不具有三螺旋结构,推测天麻多糖的基本主链结构为(α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp)_n。另外扫描电镜图谱和黏度值可知精制多糖WTM-2和WTM-3由片状物组成,为无线团构象,WTM-5由少量分支结构的的片状物构成,为支化结构,WTM-6有大量密集孔洞,结构致密,为支化结构。X射线衍射知各精制天麻多糖的结晶性很差,判定为无定型结构。(4)本实验采用了三种肿瘤细胞(肝癌细胞HepG 2,宫颈癌细胞Hela,人肺癌A549细胞)对精制天麻多糖(WTM-2、WTM-3、WTM-5和WTM-6)进行抗肿瘤活性研究,结果表明四种精制天麻多糖对(肝癌细胞HepG 2,宫颈癌细胞Hela)均具有一定的抗肿瘤活性,而且抗肿瘤能力基本随着浓度的增加而有所增加,且分子量高的多糖抑制能力越强。但四种多糖对人肺癌A549细胞表现的活性不同,除WTM-6对其有明显的活性(浓度对其几乎没有影响)外,其余三种多糖基本上呈现阴性反应,对其没有抑制作用。结论:本实验通过研究同一提取方法得到的天麻粗多糖经一系列分离纯化操作后得到不同分子量天麻多糖的体外抗肿瘤活性实验,发现天麻多糖在一定分子量范围内对肿瘤细胞(肝癌细胞HepG 2和宫颈癌细胞Hela)具有抗肿瘤作用,分子质量越高抗肿瘤活性越强,且多糖浓度越高抑制力越强。通过多糖对人肺癌A549细胞产生的结果可知,精制天麻多糖不是广谱抗肿瘤药物,具有选择性。本实验通过对天麻多糖的化学结构、体外抗肿瘤活性的研究为下一步进行多糖分子机制研究及在食品、医药和保健等领域的应用奠定了基础。