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第一部分:基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化
研究背景:
分拣蛋白相关受体,含L(DLR类)A重复(sortilin-relatedreceptor,L(DLRclass)Arepeats-containing,SORL1orSorLA)是一种Ⅰ型跨膜蛋白,根据其基因结构特点,又称为LR11。SORL1基因位于11q23.2-q24.2,它所编码的蛋白分子量约为250kD,是一种脂蛋白受体同源体,大量存在于脑内海马、齿状回及大脑皮质的神经细胞内;同时作为一种分选蛋白受体穿梭于胞膜、胞浆、高尔基体和核内体之间,参与神经细胞物质转运和信号转导的过程。2004年Scherzer等首次发现阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)患者脑内SORLl表达水平下降,揭示SORLl可能在AD的发病机制中发挥着重要作用。随后,大量的遗传学研究表明SORLl的基因多态性与AD相关,特别是在散发性AD(SporadicAlzheimersDisease,SAD)患者的脑脊液中也发现SORLl蛋白表达水平明显下降。因此,普遍认为SORL1是继APOEε4之后发现的与散发性阿尔茨海默病(AlzheimersDisease,AD)关系最为密切的风险因子之一。本实验通过基因工程方法,分析SORL1蛋白亲疏水性,选择亲水性较好的人SORL1cDNA片段,将其亚克隆至原核表达载体,产生高纯度基因重组人SORL1蛋白质片段,为制备SORL1蛋白抗体提供样品保障。
目的:
制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病(AlzheimersDisease,AD)的发病机制提供实验基础。
方法:
采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增人SORL1cDNA编码区(5923-6260bp)片段,将扩增正确的目的基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,挑取阳性菌落进行测序;再将测序正确的质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS,IPTG诱导蛋白表达,用液相色谱法纯化基因重组蛋白。
结果:
1.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实扩增出一条清晰特异的358bp基因片段,其ATG和TGA之间的结构与人SORL1cDNA的5923-6260区完全一致;
2.经酶切(NcoⅠ和SalⅠ)、测序鉴定,成功构建了基因重组质粒pET-28a(+)-hSORL1cDNA(5923-6260bp);
3.基因重组质粒在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中;
4.纯化后的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,其表观分子量约为13kDa。
结论:
基因重组型人SORL1cDNA(5923-6260bp)片段在原核细胞中大量表达,纯化后的重组蛋白可尝试用于SORL1蛋白抗体的制备。
第二部分:SORL1蛋白抗体的制备
研究背景:
阿尔茨海默病是痴呆中最常见的一种形式,易导致神经元渐进性死亡,使调节记忆和高级认知功能的脑区受损。致病基因突变可以解释约2%的AD病例。对于大多数散发性AD的核心发病机制仍然不清楚。SROL1是一个多区域蛋白,且与低密度脂蛋白受体同源,具有物质运输、分子伴侣、信号转导以及蛋白分选等多种生物学功能。大量的文献研究表明SORL1基因是散发性AD的一个新的遗传因素;在AD病理改变出现以前SORL1蛋白已有变化;单独或联合检测CSF中SORL1蛋白水平,将有助于散发性AD的早期诊断,并相应提高AD诊断的准确率。因此,制备出亲和力好、纯度高的SORL1蛋白抗体就显得尤为重要,它可以从分子、细胞和器官水平上,研究SORL1蛋白结构与功能之间的关系,及时地检测出其在体内的细微改变。1975年,K(o)hler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。其产生的单克隆抗体理化性质单一,生物活性单一,与抗原可以特异性结合,该技术已被广泛地应用的科研工作中,为成功制备SORL1蛋白抗体奠定了理论基础。
目的:
制备特异性好、灵敏度高的抗SORL1蛋白多克隆抗体和单克隆抗体,建立SORL1的定量分析方法,有助于AD的早期诊断及其发病机制的研究。
方法:
用纯化后的基因重组型人SORL1蛋白质片段,免疫日本大耳兔,制备多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价、免疫印迹法检测纯度和抗体的特异性。用纯化后的基因重组型人SORL1蛋白质片段,免疫Bal/c小鼠。取免疫后的Bal/c小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下进行细胞融合、HAT杂交瘤培养基选择性培养。以纯化后的重组蛋白为抗原,经间接ELISA、Westernblot方法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法克隆化培养获得稳定的分泌抗SORL1单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,及时冻存细胞株。
结果:
1.免疫日本大耳兔收获抗血清,ELISA显示抗体效价为1/20000,具有高度特异性;Westernblot结果显示制备的多抗可以与基因重组型人SORL1蛋白质片段及大脑脑匀浆中的天然SORL1蛋白特异性结合;
2.获得了三株分泌单克隆抗体稳定、生长状态良好的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为3H10、5G12、10A6;
3.ELISA显示三种细胞株分泌抗体的效价强弱为:3H10>10A6>5G12;
4.ELISA、Westernblot显示阳性杂交瘤细胞培养上清可以与基因重组型人SORL1蛋白质片段及大脑脑匀浆中的天然SORL1蛋白特异性结合。
结论:
成功制备了兔抗人SORL1蛋白的多克隆抗体;获得了三株分泌小鼠抗人SORL1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清不仅可以与重组蛋白反应,而且还可以与天然蛋白特异性结合。