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1研究目的芥子和莱菔子是十字花科植物中含硫代葡萄糖苷类成分的代表性中药,生炒饮片药效活性各有侧重,临床上多用炒制品且炒后都具有相似的药效变化,均长于止咳化痰,但其炒后药效物质发挥药效的作用途径以及体内代谢规律尚不明确。本研究在前期生炒饮片化学成分变化研究的基础上,进行芥子及莱菔子炮制前后等6种饮片镇咳、祛痰生物活性比较,筛选出药效最佳的饮片;并从药动学角度,采用UPLC-MS/MS法探讨正常大鼠单次口服给药后不同时间点血药浓度的变化情况;进一步在哮喘病理状态下,观察不同时间点同步取样血药浓度与药理效应的相互关联;旨在通过体内的经时代谢变化规律研究,结合前期体外药效物质基础分析结果,与体内药效学研究结果关联,揭示芥子和莱菔子炮制前后体外化学成分-体内代谢变化规律-药效之间的相互关系,寻找其镇咳、祛痰、平喘的药效物质基础,为临床合理用药提供科学依据。2研究内容2.1芥子和莱菔子生炒饮片镇咳、祛痰药效学比较研究2.1.1芥子和莱菔子生炒饮片对小鼠氨水引咳模型的作用筛选方法:首先预筛出2 min内咳嗽潜伏期少于90 s且咳嗽次数超过5次的敏感小鼠112只,按体重将敏感小鼠随机分为对照组;吐温组;生白芥子高、低剂量组;炒白芥子高、低剂量组;生黄芥子高、低剂量组;炒黄芥子高、低剂量组;生莱菔子高、低剂量组;炒莱菔子高、低剂量组等14组,每组8只,连续口服给药5天,末次给药后30 min,进行氨水雾化刺激20 s,记录各组小鼠2 min内咳嗽次数和咳嗽潜伏期。结果:与对照组比较,6种饮片中炒莱菔子和炒黄芥子高、低剂量组均能延长小鼠咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数(P<0.05,P<0.01);且炒莱菔子与生品比较,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2.1.2芥子和莱菔子生炒饮片对小鼠酚红排泌模型的作用筛选方法:按体重随机将小鼠分为对照组;吐温组;生白芥子高、低剂量组;炒白芥子高、低剂量组;生黄芥子高、低剂量组;炒黄芥子高、低剂量组;生莱菔子高、低剂量组;炒莱菔子高、低剂量组等14组,每组8只,连续口服给药5天,末次给药30min,各组小鼠腹腔注射0.5%酚红溶液0.5 mL,30 min后处死测定气管内酚红排泌量。结果:与对照组比较,6种饮片中炒莱菔子高剂量组、生白芥子高、低剂量组、炒黄芥子低剂量组均能显著增加小鼠气管酚红排泄量(P<0.05,P<0.01);且炒莱菔子高剂量组与生品比较,差异具有显著性(P<0.05)。综上,炒莱菔子镇咳和祛痰药效活性优于芥子生炒饮片等5种,作为下一步药代实验的试药。2.2炒莱菔子在正常大鼠体内单次给药的药代动力学研究2.2.1UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中芥子酸和芥子苷成分分析方法的建立方法:采用HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱,流速0.3 mL·min-1,进样量5μL进行色谱分离,采用电喷雾离子源,负离子检测模式,离子对选择芥子酸m/z 223.1～164.1,芥子苷m/z 358.0～97.0,尼泊金丁酯m/z 193.0～121.0,多反应监测方式进行质谱扫描,对准确度、精密度、回收率等进行方法学考察。结果:芥子酸和芥子苷成分的线性关系均良好(r>0.999),日内及日间精密度RSD均小于4.1%,回收率RSD处于0.8%～3.1%,待测成分及内标无明显基质效应,稳定性良好。该法简单、灵敏度高,符合生物样品的分析要求。2.2.2不同剂量炒莱菔子在正常大鼠体内单次给药的药代动力学研究方法:根据临床给药剂量设计低、中、高3个剂量组(4.5、9、18 g·kg-1),以正常大鼠为实验对象,建立药物吸收动力学模型,测定各组大鼠给药前0时和口服炒莱菔子醇溶液后 0.083,0.167,0.333,0.5,1,1.5,2,2.5,3,6,9 h后血浆中芥子酸和芥子苷的浓度,应用DAS3.2.8软件非房室模型计算相关药动学参数。结果:正常大鼠口服给予4.5、9、18 g·kg-1炒莱菔子醇提物后,血浆中芥子酸药峰浓度(Cmax)分别为(29.35± 10.32),(62.70±27.47),(137.33±40.95)μg-L/1;药时曲线下面积(AUC0-t)分别为(92.83±27.16),(240.74±75.09),(633.95±195.88)μg·L-1·h;达峰时间(Tmax)分别为(2.58±0.80),(3.00±0),(5.50±1.23)h;与炒莱菔子醇提物低剂量组比,炒莱菔子醇提物中、高剂量组的AUC0-t,平均滞留时间(MRT0-t)均显著增加(P<0.05,P<0.01);芥子酸体内AUC0-t在4.5～18 g·kg-1线性依赖性良好,本次未检测出芥子苷成分。2.3炒莱菔子在哮喘大鼠体内药代动力学-药效动力学(PK-PD)相关性研究2.3.1大鼠哮喘模型建立及评价方法:采用第1,8天腹腔注射卵清白蛋白(OVA)佐以Al(OH)3致敏,1%OVA生理盐水溶液雾化2周建立过敏性哮喘大鼠模型,采用行为学观察、白细胞计数和分类以及酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清炎症因子含量进行模型评价。结果:与对照组比较,模型组大鼠出现抓鼻,打喷嚏,咳嗽,毛发光泽暗淡等现象,且全血中嗜酸性粒细胞,中性粒细胞以及白细胞总数均明显增加(P<0.05,P<0.01),此外,血清中白细胞介素-5(IL-5),总免疫球蛋白E(IgE),肿瘤坏死因α(TNF-α)含量显著增加(P<0.05,P<0.01),提示造模成功。2.3.2炒莱菔子在哮喘大鼠体内药代动力学-药效动力学(PK-PD)研究方法:从雾化之日起,雾化前0.5 h开始给药,连续3周,UPLC-MS/MS法测定最后一次给药后血浆中 0.083,0.167,0.5,1,1.5,3,4.5,6,7.5,9h 芥子酸和芥子苷浓度。同时ELISA法测定相应时间点血清中IL-5、IgE、TNF-α含量,获得评价过敏性哮喘的药效学指标,采用DAS3.2.8软件拟合PK-PD模型。结果:哮喘大鼠分别灌胃4.5、9 g·kg-1炒莱菔子醇提物后0.083,0.167 h,与模型组比较,血清中IL-5,IgE,TNF-α含量均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01);血浆中芥子酸 Cmax分别为(58.43±27.94),(61.16±18.79)μg·L-1;AUC0-t 分别为(188.75±37.07),(247.90±36.89)μg·L-1·h;AUC0-t,表观分布容积(Vz/F)和清除率(CLz/F)均随剂量增加而增加;血浆中芥子苷Cnax分别为(6.38±2.94),(7.03±3.83)μg·L-1;AUC0-t分别为(23.28±11.60),(22.24±10.83)μg·L-1·h;Vz/F和CLz/F均随剂量增加而增加。经DAS3.2.8软件数据分析,结果提示芥子酸和芥子苷最佳药动学模型分别拟合为血管外给药的一房室模型和三房室模型,并建立了以效应室连接的Emax模型,PK-PD模型可能适用于间接连接模型。3结论莱菔子经炒制后,镇咳、祛痰、平喘作用优于芥子等5种生炒饮片,炒莱菔子在哮喘大鼠体内芥子酸和芥子苷血药浓度与血清中IL-5,IgE,TNF-α含量存在一定的相关性,且给药剂量和动物的机能状态(病理或生理状态)均会影响炒莱菔子中芥子酸和芥子苷在大鼠体内的药代动力学行为,并与其平喘药效有一定的关联性。