论文部分内容阅读
强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一种主要侵犯人体中轴关节系统以及外周大关节的慢性进行性炎症性疾病，其特征性病理改变是肌腱和韧带附着点的慢性炎症，部分患者还伴有不同程度的眼、肺、心血管、肾等其他病变。AS的病因尚不清楚，以脊柱为主要部位的炎症和新骨形成是其两大主要病理特征，尽管一直以来的观点认为是炎症促发了新骨的形成，但并没有足够的证据能证明二者之间的联系。遗传因素、环境因素和免疫因素等均可能与AS的发病相关。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两种遗传标记后的第三代遗传分子标记。约2/3的SNPs位点位于非编码区DNA中，少数位于基因内部。SNPs对于开展致病基因的定位和人类起源与进化的研究非常重要。据估计，大约有105个SNP分子标记将被用于基因功能及与疾病相关性的关联研究。
白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)是一种重要的前炎性细胞因子，具有广泛的生物学效应，被认为是细胞因子网络中的关键因子之一。它不仅在免疫反应中起重要调节作用，而且与多种疾病的病理变化有关。
AS有明显的家族聚集性，HLA-B27是所有AS遗传易感基因中最重要和研究的最深入和最透彻的一个。近年来，全基因组扫描、连锁和关联分析结果提示：除HLA-B27基因与强直性脊柱炎(AS)强相关以外，在HLA区内外还存在其他AS的易感基因。目前的大多数IL-1基因簇SNP与AS的相关研究都认为两者存在联系，但各研究的主要相关多态性位点有差异，同时也有3个阴性结果的研究。可见它且具有明显的人种差异，有关中国人群IL-1基因多态性与AS的相关性尚不明确，而且很少研究IL-1基因多态性与强直性脊柱炎患者临床表现的相关性。
我们拟进一步研究中国人群IL-1基因簇SNP以明确其与AS主要的遗传相关性，以及临床症状与遗传因素的相关性，进一步研究明确IL-1基因变异在不同种族AS致病性的作用和起主要作用的变异位点，为AS的遗传发病机制提供理论依据。探讨IL-1易感基因型的功能变化和意义，尤其在AS病人是否表达异常及意义，为阐明AS的发病机制提供新的思路并为AS的治疗提供可能的新的靶点。
第一部分IL-1基因多态性与中国AS的关联分析
背景和目的:全基因组扫描、连锁和关联分析结果提示：除HLA-B27基因与强直性脊柱炎(AS)强相关以外，在HLA区内外还存在其他AS的易感基因。目前的大多数IL-I基因簇基因多态性与AS的相关研究都认为两者存在联系，但各研究的主要相关多态性位点有差异，同时也有3个阴性结果的研究。可见它且具有明显的人种差异，有关中国南方人群IL-I基因多态性与AS的相关性还不明确。而且很少研究IL1基因多态性与强直性脊柱炎患者临床表现的相关性。我们拟进一步研究中国人群IL-1基因簇SNP以明确其与AS主要的遗传相关性，以及临床症状与遗传因素的相关性。方法:AS诊断按照1984年修订的纽约诊断标准，我们根据文献检索和Meta分析结果对强直性脊柱炎患者和相匹配的健康对照者的IL-I基因簇中的5个SNP(IL1β+3953，β-511，F10-3，RN.4，RN.6/1)和IL1RN.VNTR，用PCR-RFLP方法进行基因分型，用X2检验进行统计分析基因型与AS发病的关系，并计算比值比OR及95％可信区间CI。使用SHEsis分析软件比较病例和对照组之间等位基因，基因型，单倍体频率。结果:经HWE检验5个多态性位点基因型频率符合Hardy-weinberg遗传平衡，具有群体代表性。IL1F10.3的等位基因C在强直性脊柱炎患者中相对健康对照明显增高(p=0.001，OR=1.54，95％CI=1.19～1.20； p=0.002)。IL1B-511，IL1B+3953和RN4在病人和对照者之间都存在很强的连锁不平衡(D>0.95)。这些基因型配对的单倍体与强直性脊柱炎也发现强的相关性。等位基因组合B-511-T/B+3953-C/F10.3-C/RN4-T/RN2VNTR-1/RN6.1-C与强直性脊柱炎也发现强的相关性(p=3.32*10-5，OR=4.41，95％CI=2.1～9.3)。临床表现中RN2VNTR A2显示与外周关节炎呈现弱相关(OR=0.2，95％CI=0.07～0.91)。结论:中国人群IL-1基因与强直性脊柱炎相关；并提示临床表现中外周关节炎和IL-1基因存在可能的相关性。值得进一步在基因表达及蛋白质水平上进行IL-1功能与AS致病相关性研究。
第二部分 IL-1基因多态性与AS的家系连锁分析
背景和目的：AS作为一种复杂性疾病，遗传因素在发病中起了主导作用。近年来，随着分子遗传学技术的发展和人类基因组研究的深入，显示了AS遗传易感性的多基因模式。通过全基因扫描，证实AS除HLA-B27以外，尚有HLA区域内外的其他易感基因参与。国外有很多关于IL-1基因多态性与AS相关性的报道，但不同人群研究结果不尽相同。我们进行的病例-对照关联性分析研究证实中国人群IL-1基因簇与AS相关，为先前发现的相关性提供统计学上的支持。我们拟进行家系连锁分析，探究IL-1基因簇与AS相关性，进一步为先前发现的相关性提供实验依据。
方法:我们用含620901个SNPs的高密度HumanHap610-quad基因芯片和Beadstudio芯片扫描仪对一个小家系6例AS患者的IL-1基因进行SNP扫描。根据Illumina Infinium arrays进行基因分型，并对照1000个广东健康志愿者样本的基因型数据，计算每对SNPs间的LD。共137393个常染色体SNPs用于连锁分析，利用MERLIN软件分别进行多点的非参数和参数连锁分析。疾病模型采用常染色体显性遗传，发病率0.003，非携带者和携带者的外显率各为0.001和0.56。
结果:一个AS家系6例AS患者全基因组SNPs扫描后发现，座落在IL-1A(11327963-113259442)的有2个SNP，分别为rs12617952、rs4577331；另有12个SNP出现在IL-1B(113303808-113310827)位置，分别为rs3115011、rs4378857、rs9287422、rs3109156、rs3109156、rs3109156、rs6712250、rs16837640、rs12616464、rs2315509、rs2315523、rs6719342、rs4362616。这14个SNPs的LOD值均为参数联锁分析LD为-0.759，小于1.0。
结论:该家系全基因组SNPs扫描的连锁分析未发现IL-1显著与AS相关的证据，但不能排除IL-1是AS的易感基因，需继续扩大家系积累更多病例来进一步验证其相关性。
第三部分强直性脊柱炎患者IL1F10-3和IL1RN2VNTR基因炎性细胞因子mRNA表达及其意义的初步研究
背景和目的：白细胞介素1(IL-1)是强直性脊柱炎(AS)易感基因之一，其多态性与疾病易感性相关，不同人群的研究结果不尽相同。我们检测263例AS和260例健康对照者，进行Case-Control相关性研究，结果显示IL1F10-3(T>C)与AS具有相关性(p=0.001，OR=1.54，95％CI=1.19～1.20)，且IL1RN2VNTR A2与AS外周关节炎发病风险呈弱相关性(OR=0.2，95％CI=0.07～0.91)，证实中国人群IL-1在基因水平与AS相关。为进一步从功能上证实其相关性，我们初步在mRNA水平验证其相关性及相关的等位基因类型。
方法：病例选择：IL1F10-3等位基因为TT，TC，CC者各20例，及IL1RN2VNTR基因型A1，A2各20例。采用实时荧光定量PCR(Real-Time-QPCR)方法检测外周血单核细胞(PBMCs)IL-1β、IL-1RA、TNF、COX2等炎性细胞因子mRNA表达情况，应用方差(F检验)检验组间差异性；对有相关趋势的变量进行相关分析，分析IL-1F10-3/IL1RN2VNTRT组IL-1β与IL-1RA、TNF-α和COX-2之间mRNA表达的相关性。
结果：IL-1F10-3组中TC基因型AS患者PBMCsIL-1RA、IL-1β、TNF-αmRNA表达均明显增高(p<0.005)；IL1RN2VNTRT组中A2基因型AS患者PBMCsCOX-2mRNA表达明显增高(p<0.005)。IL-1F10-3组PBMCs mRNAIL-1β与IL-1RA、TNF-α正相关；IL1RN2VNTRT组PBMCs mRNAIL-1β与COX-2正相关(p<0.05)。
结论：IL1F10-3等位基因TC杂合型IL-1/TNFmRNA表达增强，增加AS发病风险，支持前基因多态性研究结果。IL1RN2VNTRT*A2基因型增强COX-2mRNA表达。IL1F10-3及IL1RN2VNTR基因多态性在mRNA水平分别影响IL-1β、IL-IRA、TNF及COX2表达，协同作用影响AS的致病性和表型。从mRNA水平证实IL-1是AS临床表现和遗传性的相关因素之一，可以进一步在蛋白质水平证实其结果。