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研究背景及目的:肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理途径,进一步可进展为肝硬化、肝癌,严重威胁人类健康。研究表明肝纤维化阶段是可逆的。因此,逆转肝纤维化具有非常重要的临床意义。但是,肝纤维化发病机制仍未完全阐述清楚。既往研究表明肝脏巨噬细胞在肝纤维化发生发展中具有重要作用。肝脏巨噬细胞主要包括两类:一类是常驻于肝脏中的巨噬细胞,也被称为KCs（Kupffer cells）,大约占全身巨噬细胞总数的80%,在肝脏炎症免疫反应中起到重要作用,并对维持肝脏正常代谢功能至关重要;另一类巨噬细胞是招募于骨髓来源的单核巨噬细胞。研究表明NOX2和NLRP3炎症小体对巨噬细胞功能的发挥均具有重要作用,然而它们之间的相互调控关系以及它们如何影响巨噬细胞功能的发挥尚不明确。目前临床上缺乏有效的抗肝纤维化药物。熊果酸（Ursolic acid,UA）是一种中药单体,具有抗炎、抗氧化和护肝等作用,被认为是一种有潜力的抗纤维化药物。然而,UA的抗肝纤维化机制目前尚未明了。本研究将进一步探索肝纤维化发生发展的分子机制并观察UA对肝纤维化小鼠肝脏巨噬细胞活化与焦亡的影响,从而为寻找新的治疗靶点以及为UA抗肝纤维化提供新的理论依据。材料与方法:一、UA对小鼠肝纤维化发生发展的影响1.C57BL/6J小鼠随机分为3组:Control组、肝纤维化模型组和UA组。Control组小鼠腹腔注射橄榄油对照处理;肝纤维化模型组按1ml/kg腹腔注射浓度为20%的四氯化碳溶液（Carbon tetrachloride,CCl4）,共6周,2次/周;UA组小鼠在CCl4腹腔注射2周后,从第三周开始给予50mg/kg UA灌胃,1次/日,共4周;并同时继续给予CCl4腹腔注射4周,2次/周。2.肝脏HE染色、Masson染色、天狼星红染色评估肝脏结构破坏、瘢痕形成和胶原沉积情况。3.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）检测肝脏Col1a1、α-SMA表达情况。4.WB（Western blot）和q-PCR检测肝纤维化相关蛋白及m RNA表达,如Col1a1、α-SMA、MMP1和TIMP-1。5.检测血清丙氨酸转氨酶（Alanine Transaminase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）水平,以评估肝功能损伤情况。二、UA对肝脏巨噬细胞活化与焦亡的影响1.C57BL/6J小鼠随机分为3组:Control组、肝纤维化模型组和UA组。造模方法同第一部分。2.WB和q-PCR检测肝脏组织中巨噬细胞活化相关指标,如F4/80、Ly6C、CD11b、IL-6、TNF-α、i NOS和CXCL10等;ELISA检测血清炎症因子TNF-α、IL-6、i NOS、IL-10和TGF-β;以评估UA对小鼠肝脏巨噬细胞活化的影响。3.WB检测肝脏组织中细胞焦亡相关指标,如Caspase-1/Caspase-1 p20、GSDMD/GSDMD-N、IL-1β;TUNEL染色检测阳性面积百分比;IHC检测Caspase-1;ELISA检测血清IL-1β和IL-18及血清LDH含量检测;以评估UA对小鼠肝脏细胞焦亡的影响。4.采用LPS+H2O2体外构建KCs活化模型,LPS+Nig（Nigericin）体外构建KCs焦亡模型。5.WB和q-PCR检测各组KCs活化相关指标,如F4/80、Ly6C、IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS、MCP-1和CXCL10等;ELISA检测细胞上清炎症因子TNF-α、IL-6、i NOS、IL-10和TGF-β;以评估UA对KCs活化的影响。6.WB检测各组KCs焦亡相关指标,如Caspase-1/Caspase-1 p20、GSDMD/GSDMD-N、IL-1β;TUNEL染色阳性细胞百分比;细胞流式检测PI和Caspase-1双标阳性细胞百分比;ELISA检测各组细胞上清IL-1β和IL-18及LDH含量;以评估UA对KCs焦亡的影响。三、UA体外调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路对KCs活化与焦亡的影响1.体外构建KCs活化模型和KCs焦亡模型;WB和q-PCR检测各组KCs中NOX2和NLRP3蛋白与m RNA的表达,以评估KCs活化和焦亡中NOX2和NLRP3的表达情况及UA对NOX2和NLRP3的影响。2.使用小干扰RNA（Si-RNA）对KCs中NOX2和NLRP3基因进行沉默,LPS+H2O2刺激细胞,根据实验目的进行分组。3.WB和q-PCR检测各组KCs活化相关指标,ELISA检测细胞上清炎症因子,以评估NOX2/NLRP3在KCs活化中的重要作用及UA是否通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路调控KCs活化。4.使用Si-RNA对KCs中NOX2和NLRP3基因进行沉默,LPS+Nig刺激细胞;根据实验目的进行分组。5.WB检测各组焦亡相关蛋白表达,TUNEL染色检测阳性细胞百分比;细胞流式检测PI和Caspase-1双标阳性细胞百分比,ELISA检测各组细胞上清IL-1β和IL-18及细胞上清LDH含量检测,以评估NOX2/NLRP3在KCs焦亡中的重要作用及UA是否通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路调控KCs焦亡。四、UA体内调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制肝脏巨噬细胞活化及细胞焦亡对小鼠肝纤维化的影响1.体内实验探究UA是否通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路调控肝脏巨噬细胞活化、细胞焦亡及肝纤维化。分别使用NOX2和NLRP3的特异性抑制剂GSK2795039和MCC950处理小鼠。实验分组:Control组、肝纤维化模型组、UA组、GSK组、GSK+UA组、MCC950组和MCC950+UA组。2.肝脏HE、Masson染色、天狼星红染色、IHC检测Col1a1和α-SMA、WB和q-PCR检测肝纤维化相关指标和血清ALT、AST检测,以评估各组肝纤维化情况。3.WB和q-PCR检测各组肝脏巨噬细胞活化相关指标,ELISA检测血清炎症因子,以评估各组肝脏巨噬细胞活化情况。4.WB检测各组肝脏细胞焦亡相关指标,TUNEL染色阳性面积百分比,ELISA检测各组血清IL-1β和IL-18及血清LDH含量检测,以评估各组肝脏细胞焦亡情况。结果:一、UA对小鼠肝纤维化发生发展的影响1.小鼠肝纤维化模型建立与对照组相比,肝纤维化模型组肝脏HE、Masson染色、天狼猩红染色和WB实验结果表明肝脏结构破坏、瘢痕形成、纤维间隔和胶原沉积等明显增加（P＜0.05）。2.UA减轻小鼠肝小叶破坏和胶原纤维沉积与肝纤维化模型组相比,UA组肝脏HE、Masson染色、天狼猩红染色和IHC检测Col1a1显示肝脏结构破坏、瘢痕形成、纤维间隔和胶原沉积显著减轻（P＜0.05）。3.UA缓解小鼠肝功能损伤及下调羟脯氨酸表达与肝纤维化模型组相比,UA组血清ALT、AST和羟脯氨酸含量明显下降（P＜0.05）。4.UA抑制小鼠肝纤维化相关蛋白和基因表达与肝纤维化模型组相比,UA组肝纤维化相关蛋白和m RNA,如Col1a1、α-SMA和TIMP-1等明显下降（P＜0.05）。二、UA对肝脏巨噬细胞活化与焦亡的影响1.UA抑制肝纤维化小鼠肝脏巨噬细胞活化（1）与肝纤维化模型组相比,UA组WB检测肝脏巨噬细胞活化相关蛋白,如F4/80、CD11b和Ly6C蛋白被显著下调（P＜0.05）;（2）与肝纤维化模型组相比,UA组q-PCR检测肝脏巨噬细胞活化相关指标,如F4/80、Ly6C、IL-6、TNF-α、i NOS和CXCL10 m RNA表示均显著下调（P＜0.05）;（3）与肝纤维化模型组相比,UA组ELISA检测血清炎症因子,如TNF-α、IL-6、i NOS和TGF-β显著降低（P＜0.05）。2.UA抑制肝纤维化小鼠肝脏细胞焦亡（1）与肝纤维化模型组相比,UA组WB检测细胞焦亡相关蛋白,如Caspase-1 p20、GSDMD-N和IL-1β明显下调（P＜0.05）;（2）与肝纤维化模型组相比,UA组TUNEL染色显示阳性面积百分比明显减少（P＜0.05）;（3）与肝纤维化模型组相比,UA组IHC检测肝脏Caspase-1阳性面积明显减少（P＜0.05）;（4）与肝纤维化模型组相比,UA组ELISA检测血清炎症因子IL-1β和IL-18明显下降,血清LDH含量亦明显下降（P＜0.05）。3.UA体外抑制KCs活化（1）与LPS+H2O2组相比,LPS+H2O2+UA组WB检测KCs活化相关蛋白,如F4/80、Ly6C和IL-1β表达均被显著下调（P＜0.05）;（2）与LPS+H2O2组相比,LPS+H2O2+UA组q-PCR检测KCs活化相关指标,如F4/80、Ly6C、TNF-α、IL-6、i NOS、IL1β、MCP-1和CXCL10 m RNA表达均显著下降（P＜0.05）;（3）与LPS+H2O2组相比,LPS+H2O2+UA组ELISA检测细胞上清炎症因子,如TNF-α、IL-6、i NOS和TGF-β表达显著降低（P＜0.05）。4.UA体外抑制KCs焦亡（1）与LPS+Nig组相比,LPS+Nig+UA组WB检测KCs焦亡相关蛋白,如Caspase-1 p20、GSDMD-N和IL-1β表达被显著下调（P＜0.05）;（2）与LPS+Nig组相比,LPS+Nig+UA组TUNEL染色KCs阳性细胞百分比明显减少（P＜0.05）;（3）与LPS+Nig组相比,LPS+Nig+UA组细胞流式检测KCs中PI和Caspase-1双阳细胞百分比显著减少（P＜0.05）;（4）与LPS+Nig组相比,LPS+Nig+UA组ELISA检测细胞上清炎症因子,如IL-1β和IL-18明显下降,细胞上清LDH含量亦明显减少（P＜0.05）。三、UA体外调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路对KCs活化与焦亡的影响1.UA抑制KCs活化与焦亡中NOX2和NLRP3蛋白和基因表达（1）与LPS+H2O2组相比,UA可以显著抑制NOX2和NLRP3蛋白和m RNA表达;（2）与LPS+Nig组相比,UA亦可显著抑制NOX2和NLRP3蛋白和m RNA表达。2.沉默NOX2和NLRP3基因的小干扰片段验证使用Si-RNA对KCs中NOX2和NLRP3进行沉默,以验证Si-RNA沉默NOX2和NLRP3的效率。（1）对NOX2进行沉默,WB和q-PCR检测各组NOX2蛋白和m RNA表达水平,以筛选出沉默效率最高的Si-RNA片段用于后续实验,实验结果显示Si-NOX2-3沉默效率最高;（2）对NLRP3进行沉默,WB和q-PCR检测各组NLRP3蛋白和m RNA表达水平,以筛选出沉默效率最高的Si-RNA片段用于后续实验,实验结果显示Si-NLRP3-3沉默效率最高。3.UA调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制KCs活化采用Si-RNA沉默NOX2和NLRP3,以评估NOX2和NLRP3对KCs活化与焦亡的影响及UA的作用机制。（1）KCs活化中NOX2作为上游调控NLRP3与LPS+H2O2+Si-NC组相比,LPS+H2O2+Si-NOX2组中KCs的NOX2和NLRP3蛋白和m RNA表达均显著下降（P＜0.05）;LPS+H2O2+Si-NLRP3组中NLRP3蛋白和m RNA表达显著下调,而NOX2蛋白和m RNA表达无明显差别（P＞0.05）;（2）NOX2/NLRP3炎症小体信号通路活化可促进KCs活化与LPS+H2O2+Si-NC组相比,LPS+H2O2+Si-NOX2组和LPS+H2O2+Si-NLRP3组WB检测KCs活化相关蛋白表达均显著下降（P＜0.05）,q-PCR检测KCs活化相关指标的m RNA表达明显下调（P＜0.05）,ELISA检测细胞上清炎症因子亦显著降低（P＜0.05）;（3）UA通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制KCs活化与LPS+H2O2+Si-NOX2组相比,LPS+H2O2+Si-NOX2+UA组WB结果显示KCs活化相关蛋白表达无明显差异（P＞0.05）,q-PCR检测KCs活化相关指标的m RNA表达是相当的（P＞0.05）,ELISA检测细胞上清炎症因子无统计学差异（P＞0.05）。另外,LPS+H2O2+Si-NLRP3组和LPS+H2O2+Si-NLRP3+UA组相比,其结果与LPS+H2O2+Si-NOX2组和LPS+H2O2+Si-NOX2+UA组相比的结果是相一致的,即两组之间KCs活化相关指标无显著差异。4.UA调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制KCs焦亡（1）KCs焦亡中NOX2作为上游调控NLRP3与LPS+Nig+Si-NC组相比,LPS+Nig+Si-NOX2组NOX2和NLRP3蛋白和m RNA表达均显著下降（P＜0.05）,而LPS+Nig+Si-NLRP3组NLRP3蛋白和m RNA表达显著下调,但NOX2蛋白和m RNA表达无明显差别（P＞0.05）;（2）NOX2/NLRP3炎症小体信号通路活化可促进KCs焦亡与LPS+Nig+Si-NC组相比,LPS+Nig+Si-NOX2组和LPS+Nig+Si-NLRP3组WB检测KCs焦亡相关蛋白表达均显著下降（P＜0.05）,TUNEL染色阳性细胞百分比明显减少（P＜0.05）,细胞流式检测PI和Caspase-1双阳细胞百分比明显减少（P＜0.05）,ELISA检测细胞上清炎症因子IL-1β和IL-18明显下降,细胞上清LDH含量亦明显下降（P＜0.05）;（3）UA通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制KCs焦亡与LPS+Nig+Si-NOX2组相比,LPS+Nig+Si-NOX2+UA组WB结果显示焦亡相关蛋白表达无明显差异（P＞0.05）,TUNEL染色和细胞流式检测阳性细胞百分比无统计学差异（P＞0.05）,且细胞上清IL-1β、IL-18和LDH含量亦是相当的（P＞0.05）。另外,LPS+Nig+Si-NLRP3组和LPS+Nig+Si-NLRP3+UA组相比,其结果与LPS+Nig+Si-NOX2组和LPS+Nig+Si-NOX2+UA组相比的结果是相一致的,即两组之间KCs焦亡相关指标无明显差异。四、UA体内调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制肝脏巨噬细胞活化与细胞焦亡对小鼠肝纤维化的影响分别使用NOX2和NLRP3特异性抑制剂GSK2795039和MCC950处理小鼠,以评估NOX2/NLRP3炎症小体信号通路在体内对肝纤维化、肝脏巨噬细胞活化和细胞焦亡的影响及UA的作用机制。1.UA调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路改善小鼠肝纤维化（1）NOX2/NLRP3炎症小体信号通路参与小鼠肝纤维化发生发展过程与肝纤维化模型组相比,GSK组和MCC950组肝脏HE染色、Masson染色、天狼星红染色和IHC染色结果显示肝脏结构破坏、瘢痕形成、纤维间隔和胶原沉积明显减少（P＜0.05）,WB结果和q-PCR结果显示肝纤维化相关蛋白及m RNA,如Col1a1、α-SMA、TIMP-1等表达亦显著下降（P＜0.05）,ALT和AST检测结果提示肝功能损伤得到改善;（2）UA通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路改善小鼠肝纤维化与GSK组相比,GSK+UA组肝脏HE、Masson、天狼星红染色和IHC均提示肝脏结构破坏、瘢痕形成、纤维间隔和胶纤维化原沉积无显著差异（P＞0.05）,WB和q-PCR结果显示肝纤维化相关蛋白及基因表达亦无明显差别（P＞0.05）,并且ALT和AST检测提示肝功能是相当的（P＞0.05）。MCC950组和MCC950+UA组相比,其结果与GSK组和GSK+UA组相比的结果是相一致的,即两组中肝纤维化相关指标无明显统计学差异（P＞0.05）。2.UA调控NOX2/NLRP3炎性小体信号通路抑制小鼠肝脏巨噬细胞活化（1）NOX2/NLRP3炎症小体信号通路活化促进小鼠肝脏巨噬细活化与肝纤维化模型组相比,GSK组和MCC950组WB和q-PCR检测巨噬细胞活化相关指标蛋白和m RNA表达显著下降（P＜0.05）,ELISA检测血清炎症因子显著下降（P＜0.05）;（2）UA通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制小鼠肝脏巨噬细胞活化与GSK组相比,GSK+UA组WB和q-PCR检测巨噬细胞活化相关指标蛋白和m RNA表达无明显差异（P＞0.05）,ELISA检测血清炎症因子均无显著下降（P＞0.05）。MCC950组和MCC950+UA组相比,其结果与GSK组和GSK+UA组相比的结果是相一致的,即两组中肝脏巨噬细胞活化相关指标无统计学差异（P＞0.05）。3.UA调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制小鼠肝脏细胞焦亡（1）NOX2/NLRP3炎症小体信号通路活化促进小鼠肝脏细胞焦亡与肝纤维化模型组相比,GSK组和MCC950组WB结果显示焦亡相关蛋白表达显著降低（P＜0.05）,TUNEL染色结果显示染色阳性面积百分比明显减少（P＜0.05）,ELISA检测血清IL-1β和IL-18及血清LDH检测结果均是显著减少（P＜0.05）;（2）UA通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制小鼠肝脏细胞焦亡与GSK组相比,GSK+UA组WB检测细胞焦亡相关蛋白和m RNA表达无明显差异（P＞0.05）,TUNEL染色,ELISA检测血清炎症因子及血清LDH检测均无显著下降（P＞0.05）。MCC950组和MCC950+UA组相比的结果与GSK组和GSK+UA组相比的结果是相一致的,即两组中肝脏细胞焦亡相关指标无显著差异（P＞0.05）。结论:1.在肝脏巨噬细胞中,NOX2作为上游调控NLRP3炎症小体;2.NOX2/NLRP3炎症小体信号通路可促进肝脏巨噬细胞的活化与焦亡,可能是小鼠肝纤维化发生发展中重要的分子机制之一;3.熊果酸可能通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路在体外抑制KCs活化与焦亡、在体内抑制肝脏巨噬细胞活化与焦亡,从而发挥抗肝纤维化作用。