论文部分内容阅读
本文通过试验研究了粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对视网膜神经节细胞（retinalganglion cells, RGCs）体外存活的影响，以及对损伤后RGCs的保护作用，并探讨其可能的作用机制。实验中我们首先体外培养了RGC-5细胞系，观察其形态及性状，应用MTT法、流式细胞术、Western Blot方法检测rhG-CSF干预后RGC-5活性和增殖的变化及其机制。结果表明G-CSF能够增强体外培养RGC-5的活性、促进RGC-5的增殖、诱导RGC-5中STAT3的磷酸化，并且G-CSF-R参与STAT3的活化过程。提示G-CSF可以通过G-CSFR途径诱导RGC-5中STAT3的活化来达到促进其活性和增殖的目的。为了更加明确的说明G-CSF对视神经的保护作用，本实验选用了特异性的Thy1.1单克隆抗体联合无血清的神经基质培养基（NEUROBASALTMMedium）纯化培养大鼠视网膜神经节细胞，得到细胞纯度可高达95%。随后我们应用无血清的神经基质培养基与含血清的DMEM同时培养RGCs，进行对比观察RGCs形态学变化，应用MTT法、流式细胞术检测两组细胞的存活率及凋亡率，结果显示无血清的神经基质培养基可明显提高RGCs体外存活率及存活时间，降低RGCs体外凋亡率。这提示我们Thy-1.1单克隆抗体与NEUROBASALTMMedium联合应用于RGCs的体外纯化与培养，可明显维持体外RGCs的活性并延长其在体外的存活时间。因此利用以上方法体外培养视网膜神经节细胞，在Cocl2诱导的缺氧情况下加入rhG-CSF，应用rt-PCR及Wetern Blot方法检测RGCs上GAP-43、MAP-2、RhoA、Rock、Bcl-2、Caspase3和Bax蛋白及mRNA表达量的变化，同时应用流式细胞术检测RGCs的凋亡率，结果显示G-CSF可能通过下调RhoA、Rock表达来增加GAP-43、MAP-2蛋白及mRNA的表达量，从而促进细胞突起的生长与修复，通过上调Bcl-2的表达，下调Caspase3和Bax的表达来明显减低RGCs的凋亡率。说明G-CSF通过抗凋亡途径及增加细胞生长发育相关蛋白表达量来保护损伤后的RGCs。本文的创新点如下：1证明了G-CSF可以通过G-CSFR途径诱导RGC-5中STAT3的活化来达到促进RGC-5活性和增殖的目的。2G-CSF可能通过下调RhoA、Rock表达量及增加GAP-43、MAP-2的表达量来促进RGCs突起的再生与修复。