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拟除虫菊酯农药是目前仅次于有机磷和氨基甲酸酯农药的一类杀虫剂，约占世界杀虫剂的20％。广谱性菊酯类农药如氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯在现代农业中广泛应用，其残留对生态环境产生了一定的影响。农药残留已成为突出的环境问题，越来越受到人们的关注。利用微生物降解的方法，解决农药污染尤其是菊酯类农药残留问题，已成为当前食品安全领域的研究热点。
本文从农药厂的污泥中筛选到7株能降解菊酯类农药的细菌，并选取了一株降解效能高的菌株ZD112作为本论文的研究对象。通过生理生化研究和16SrDNA分子鉴定，初步鉴定该菌株为Klebsiella sp．。根据已知的文献资料并结合GenBank检索，该菌株为菊酯农药降解的一个新种。ZD112能以菊酯作为唯一碳源进行生长，其降解菊酯的最适温度是35℃，最佳pH是7.0。研究了外界环境条件对菌株Klebsiella sp．ZD112的生长和降解能力的影响。菌株ZD112产生的菊酯降解酶为胞内酶，该降解酶的最适反应条件是：最适温度45℃，最佳pH是6.6，以氯氰菊酯为底物，粗酶的米氏动力常数是：Km=0.33 μmol．Vmax=105.32nmol/min。
为了获取菌株ZD112的菊酯降解酶基因，本论文构建了该菌株的基因组文库。通过将转化子依次挑取到终浓度100 μg/ml Amp和100μM X-caprylate的LB平板上，挑取蓝色水解圈的菌落用于初步筛选具有菊酯降解活性的转化子。其中一个含有3.5 kb的HindⅢ酶切片段转化子具有菊酯降解活性，经测序比对，该片段内含一个由819 bp的开放阅读框架，编码272个氨基酸。实验结果表明为一新的菊酯农药降解酶基因(pyrethroid-hydrolyzing esterase，estP)。同源性分析表明，该ORF与Klebsiella pneumoniae subsp．pneumoniae MGH 78578的乙酰辅酶A硫酯酶Ⅰ有94％的同源性，与Escherichia coli Ell0019的Lysophospholipase L181％的同源性，其GenBank登录号为EU621840。通过PCR的方法，将estP基因从克隆载体连接到表达载体pET-32a(+)中，并转化到原核表达宿主菌E.coli Origami中。经过活性测试，发现表达蛋白具有降解菊酯的活性。SDS-PAGE电泳后在42 kDa处有特异性表达的蛋白条带。通过诱导条件优化，在28℃，pH 7.0，IPFG终浓度为0.3 mM，表达时间为8 h时，目的蛋白得到最好表达，表达的蛋白为胞内酶。酶活力测定该蛋白具有酯酶活性，且对氯氰菊酯有较强的降解能力。进一步使用Ni2+鳌合剂试剂盒对表达蛋白纯化。当以氯氰菊酯为底物时，纯化EstP Km=0.21 μmol Vmax=120.63nmol/min：以对硝基苯酚乙酸酯底物法测定纯酶的动力学常数，Km=34.33 μmol．Vmax=220.63 nmol/min。
在研究EstP蛋白性质的基础上，为了进一步提高该酶的降解能力，本论文使用随机突变试剂盒(GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis Kit)对estP进行了两轮易错PCR突变，获得5000个突变子的突变文库。使用显色底物进行突变子的初步筛选结合酯酶活性的筛选方法，获得了2个在45℃温度条件下具有高活性的突变基因，其中M223以氯氰菊酯为底物时，突变的EstP Km=0.19μmol．Vmax=156.44 nmol/min，酶活提高了80％：以对硝基苯酚乙酸酯底物，测定突变EstP酶的动力学常数，Km=33.74 μmol．Vmax=254.52 nmol/min，酶活提高了40％。通过蛋白结构和基因序列的比对，对突变酶蛋白进行了三维结构的分析。通过定向进化，提高了该酶的降解活性，为工业应用低成本和高质量的酶制剂奠定了基础，具有重要的理论意义和应用潜力。