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非生物胁迫严重影响植物的生长发育及农作物的产量。脱落酸(abscisic acid， ABA)在植物响应非生物胁迫过程中起着关键作用。在盐、干旱、低温等非生物胁迫下，植物体内的ABA被显著诱导合成，并启动一系列信号途径激活植物抗逆机制。其中ABF(ABA-responsive element binding factors)转录因子在ABA信号途径中扮演着重要的角色。在本研究中，将紫花苜蓿MsABF2基因转化到烟草中，分析该基因在非生物胁迫下的功能。主要研究结果如下：
1.MsABF2基因的组织特异性表达以及非生物胁迫下的表达模式分析
qRT-PCR分析结果表明，MsABF2基因在紫花苜蓿的根、茎、叶、花、荚中均有表达，并且在叶中的表达量最高。MsABF2基因的表达受到低温、盐、盐碱和ABA处理的诱导，并且表达量随着处理时间的增加也会有相应的变化。低温处理下，MsABF2基因在根和叶中的表达量均在24h时达到峰值；盐和盐碱处理下，MsABF2基因在叶中的表达量均在1h时达到峰值；ABA处理下，MsABF2基因在根和叶中的表达量分别在1h和12h时达到最高。
2.紫花苜蓿MsABF2基因对烟草的遗传转化
通过农杆菌介导法将MsABF2基因导入到烟草中，经潮霉素(Hyg)抗性筛选、PCR鉴定共获得25株转MsABF2基因烟草。选取长势及生长状态一致的转MsABF2基因烟草进行qRT-PCR检测，结果表明，在转MsABF2基因烟草中该基因都得到表达，其中在OE8、OE37和OE40中MsABF2基因表达量最高，用于后续的实验研究。
3.转MsABF2基因烟草的抗逆性分析
对转MsABF2基因烟草进行300mmol/LNaCl和30mmol/LNaHCO3处理下的打孔表型及整株表型实验。结果显示，转MsABF2基因烟草叶片黄化程度和萎蔫程度均低于野生型，表现出较强的耐盐、盐碱性。对转MsABF2基因烟草种子进行ABA处理下的萌发实验及竖直平板根长实验。结果显示，转MsABF2基因烟草萌发率，根长与鲜重均低于野生型。这表明MsABF2基因的过表达提高了转基因烟草对ABA的敏感性。
在盐和盐碱胁迫下，转MsABF2基因烟草的丙二醛、超氧阴离子及过氧化氢含量均低于野生型烟草，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性均高于野生型。同时，对盐、盐碱胁迫下的DAB和NBT染色实验表明，转MsABF2基因烟草的着色程度明显低于野生型烟草，说明转基因烟草与WT相比积累了较少的活性氧物质。以上研究结果表明，MsABF2基因可以增强植物对盐和盐碱胁迫的抗性。ABA含量测定结果表明，在正常和盐碱胁迫下，转MsABF2基因烟草ABA含量均显著高于野生型。这说明，MsABF2基因能够促进植物体内ABA的生物合成，进而在ABA信号通路中发挥重要作用，提高植物的抗盐碱性。
在盐碱胁迫下，与WT相比，转MsABF2基因烟草中ABA合成相关基因ABA1，NCED2上调表达，ABA信号通路负调控因子ABI1，ABI2下调表达。这表明MsABF2是ABA信号通路的正调控因子，并抑制了ABA途径的负调控机制，通过影响ABA信号通路，增强植物的耐盐碱性。同时，SOS1，SOS2等胁迫诱导基因表达量的变化，表明MsABF2基因还可以影响其他途径来响应盐碱胁迫。
1.MsABF2基因的组织特异性表达以及非生物胁迫下的表达模式分析
qRT-PCR分析结果表明，MsABF2基因在紫花苜蓿的根、茎、叶、花、荚中均有表达，并且在叶中的表达量最高。MsABF2基因的表达受到低温、盐、盐碱和ABA处理的诱导，并且表达量随着处理时间的增加也会有相应的变化。低温处理下，MsABF2基因在根和叶中的表达量均在24h时达到峰值；盐和盐碱处理下，MsABF2基因在叶中的表达量均在1h时达到峰值；ABA处理下，MsABF2基因在根和叶中的表达量分别在1h和12h时达到最高。
2.紫花苜蓿MsABF2基因对烟草的遗传转化
通过农杆菌介导法将MsABF2基因导入到烟草中，经潮霉素(Hyg)抗性筛选、PCR鉴定共获得25株转MsABF2基因烟草。选取长势及生长状态一致的转MsABF2基因烟草进行qRT-PCR检测，结果表明，在转MsABF2基因烟草中该基因都得到表达，其中在OE8、OE37和OE40中MsABF2基因表达量最高，用于后续的实验研究。
3.转MsABF2基因烟草的抗逆性分析
对转MsABF2基因烟草进行300mmol/LNaCl和30mmol/LNaHCO3处理下的打孔表型及整株表型实验。结果显示，转MsABF2基因烟草叶片黄化程度和萎蔫程度均低于野生型，表现出较强的耐盐、盐碱性。对转MsABF2基因烟草种子进行ABA处理下的萌发实验及竖直平板根长实验。结果显示，转MsABF2基因烟草萌发率，根长与鲜重均低于野生型。这表明MsABF2基因的过表达提高了转基因烟草对ABA的敏感性。
在盐和盐碱胁迫下，转MsABF2基因烟草的丙二醛、超氧阴离子及过氧化氢含量均低于野生型烟草，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性均高于野生型。同时，对盐、盐碱胁迫下的DAB和NBT染色实验表明，转MsABF2基因烟草的着色程度明显低于野生型烟草，说明转基因烟草与WT相比积累了较少的活性氧物质。以上研究结果表明，MsABF2基因可以增强植物对盐和盐碱胁迫的抗性。ABA含量测定结果表明，在正常和盐碱胁迫下，转MsABF2基因烟草ABA含量均显著高于野生型。这说明，MsABF2基因能够促进植物体内ABA的生物合成，进而在ABA信号通路中发挥重要作用，提高植物的抗盐碱性。
在盐碱胁迫下，与WT相比，转MsABF2基因烟草中ABA合成相关基因ABA1，NCED2上调表达，ABA信号通路负调控因子ABI1，ABI2下调表达。这表明MsABF2是ABA信号通路的正调控因子，并抑制了ABA途径的负调控机制，通过影响ABA信号通路，增强植物的耐盐碱性。同时，SOS1，SOS2等胁迫诱导基因表达量的变化，表明MsABF2基因还可以影响其他途径来响应盐碱胁迫。