论文部分内容阅读
作为生命体中遗传信息的携带者，核酸在生命体的延续以及进化过程中发挥着极其重要的作用。由于其在遗传学、法医鉴定、亲子鉴定以及物种进化研究等方面的广泛应用，从而使对于核酸的研究显得越来越重要。对于核酸的研究主要包括核酸的定性和定量研究。在核酸的定量研究中主要应用聚合酶链式反应技术（PCR）、高效液相色谱技术（HPLC）以及基础的化学分析方法电位滴定法和新技术数字PCR技术进行定量分析的。在核酸的定性研究中，质谱分析技术以及红外光谱分析技术被应用其中。对于核酸方面的研究，本论文研究如下：1.核酸碱基腺嘌呤以及胞嘧啶标准物质的研制腺嘌呤以及胞嘧啶是脱氧核糖核酸（DNA）中的两种碱基，由于两种物质都含有氨基基团，因此具有一定的弱碱性。实验采用非水电位滴定法对两种碱基的含量进行测定。通过进行滴定剂种类、滴定剂浓度、溶剂种类等因素进行选择优化，最终确定了0.05mol/L的无水高氯酸溶液作为滴定剂，无水冰醋酸作为溶剂定性实验。并且在后续的研究中采用了高效液相法对两种碱基进行了稳定性研究，采用质谱以及红外光谱检测对两种碱基进行了定性分析，并进行了灰分以及样品含水量的测定，经过进一步的分析得到两种碱基标准物质的含量为：腺嘌呤以及胞嘧啶两种标准物质的含量分别为99.40±0.37%，99.50±1.07%。2.数字PCR测定lambda DNA的含量数字PCR芯片技术是一项新兴起来的检定技术，由于其在测定过程中不需要标准品的校准，且具有检测浓度低、用量少等特点，目前被应用到了核酸含量的检测研究中。本研究中采用数字PCR技术进行lambdaDNA含量的测定，分析结果显示：通过数字PCR测得的Lambda DNA的含量为2.428±0.1305μg。3.采用质谱进行单核苷酸多态性研究质谱作为目前分析化学中常用的分析方法之一，由于具有操作时间短、高通量、灵敏度度高等特点，被应用到了单核苷酸多态性的实验研究中。本研究选用基质辅助激光解析-飞行时间质谱对单核苷酸多态性位点进行分析。实验中构建了线粒体DNA高可变区HV2区的序列载体，并且已构建好的质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应完成以后进一步进行PEX延伸反应以获得目的片段。随后采用固相萃取纯化方法以及链霉亲和素磁珠与ZipTip相结合的方法对通过单碱基延伸反应得到的PCR产物进行纯化，最终实验将纯化得到的PCR产物采用质谱分析设备进行分析。实验共测定了3个单核苷酸多态性位点，每个位点进行了5次重复实验，最终实验测定的单碱基分子量的结果与理论上的分子量结果基本上是一致的。4.测序反应中三种纯化方法的比较本研究目的在于建立一种纯化效果好的PCR产物纯化方法，进而为后续的测序反应提供一个良好的条件以便得到准确的测序结果。实验过程中以构建好的短串联重复片段D2S441为模板进行分析PCR扩增，扩增产物采用Agilent2100生物分析仪进行片段大小的分析，随后分别用固相萃、链霉素亲和磁珠以及纯化试剂盒等方法纯化实验得到的PCR产物，进行测序以及无机离子含量的检测。最终结果表明固相萃取纯化方法在纯化效果方面优于纯化试剂盒法以及链霉亲和素磁珠法。5.转基因油菜TOPAS19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质，具有易制备，周期短，成本低等特点。本实验采用实时荧光定量PCR技术，并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。对多家定值的数据进行了统计分析得出，TOPAS19/2质粒分子的量值结果0.910，扩展标准不确定度（K=2）为0.013。