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目的:1.通过观察营养环境及饥饿环境下抗血管生成药物贝伐单抗(bevacizumab,Bev)对人肺腺癌细胞A549增殖能力、迁移能力、侵袭能力以及细胞周期的作用,研究贝伐单抗对A549细胞内相关分子基因水平及蛋白质水平的影响,探索营养及饥饿环境下“不当(高)剂”量贝伐单抗引起A549细胞生物学行为改变的可能原因及相关机制。2.通过观察营养环境及饥饿环境下新型药物盐酸E109对人肺腺癌细胞A549增殖能力、迁移能力的作用,研究E109对A549细胞内相关分子基因水平及蛋白质水平的影响,初步探索营养及饥饿环境下不同浓度E109对A549细胞生物学行为能力的影响、并初步探索其分子机制。方法:选取生长状况良好的A549对数期细胞(即A549细胞长至70%-80%融合度时),根据前期Transwell预实验结果选择后续实验中贝伐单抗药物作用浓度分别为40μg/ml、160μg/ml、240μg/ml;利用MTT法检测营养及饥饿环境下贝伐单抗对A549细胞增殖能力的影响;利用Transwell迁移实验检测营养及饥饿环境下贝伐单抗对A549细胞迁移能力的影响;利用Transwell侵袭实验检测营养及饥饿环境下贝伐单抗对A549细胞侵袭能力的影响;利用流式细胞术检测营养及饥饿环境下贝伐单抗对A549细胞周期影响;利用二代高通量转录组测序技术筛选影响A549细胞行为学改变的相关差异基因;利用RT-PCR技术验证二代测序结果中筛选的相关基因RGC32(response gene to complement 32,又名RGCC);Western blot检测营养环境下贝伐单抗对A549细胞内RGC32蛋白、VEGF-A、MMP-2蛋白、N-cadherin蛋白表达水平的影响;Western blot检测贝伐单抗与NF-κB抑制剂PDTC同时处理A549细胞后RGC32蛋白和MMP-2蛋白表达情况。MTT方法检测营养及饥饿环境下新型药物E109对A549细胞增殖能力的影响,分别选取营养环境及饥饿环境下E109处理24h后IC5、IC30、IC50附近的浓度即营养环境下为2μmol/ml、8μmol/ml、16μmol/ml,饥饿环境下1μmol/ml、4μmol/ml、12μmol/ml进行后续Transwell迁移实验;RT-PCR实验检测营养环境下E109对RGC32基因表达量的影响;Western blot实验检测营养环境下E109对A549细胞内RGC32、MMP-2、N-cadherin蛋白表达水平的影响。结果:1.(1)营养环境下贝伐单抗处理A549细胞24h后Bev 40μg/ml组、Bev160μg/ml组及Bev 240μg/ml组对A549细胞的抑制率分别为:13.22%、10.91%、19.89%;48h后Bev 40μg/ml组、Bev 160μg/ml组及Bev 240μg/ml组对A549细胞的抑制率分别为:-10.18%、6.39%、-0.93%。饥饿环境贝伐单抗处理24h后Bev 40μg/ml组、Bev 160μg/ml组及Bev 240μg/ml组对A549细胞的抑制率分别为:5.08%、24.19%、25.33%;48h后Bev 40μg/ml组、Bev 160μg/ml组及Bev240μg/ml组对A549细胞的抑制率分别为:6.79%、12.33%、25.04%。(2)在营养或饥饿环境下分别以浓度为1μmol/ml、2μmol/ml、4μmol/ml、8μmol/ml、12μmol/ml、16μmol/ml的E109作用于A549细胞。在营养或饥饿培养环境下,当作用时间一定时(24h、48h或72h),随着药物浓度增加,E109对A549细胞的生长抑制率逐渐增加;在营养或饥饿培养环境下,当药物浓度一定时(1μmol/ml、2μmol/ml、4μmol/ml、8μmol/ml、12μmol/ml或16μmol/ml),随着作用时间延长,E109对A549细胞的生长抑制率亦逐渐增加。2.(1)营养环境或饥饿环境下,较高浓度贝伐单抗(Bev 160μg/ml、Bev240μg/ml)均可促进A549细胞的迁移能力,各高浓度组与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);较低浓度贝伐单抗(Bev 40μg/ml)可抑制A549细胞的迁移能力,低浓度组与对照组比较差异亦均有统计学意义(均P<0.05)。(2)营养培养环境下,E109处理A549细胞48h后,E109 2μmol/ml组、E109 8μmol/ml组、E109 16μmol/ml组迁移细胞数目均明显减少,且差异有统计学意义(均P<0.05);E109处理A549细胞24h后,与对照组相比,E109 2μmol/ml组迁移细胞数目未明显减少(P>0.05)、E109 8μmol/ml组、E109 16μmol/ml组迁移细胞数目明显减少,且差异有统计学意义(均P<0.05);这种现象也见于饥饿环境培养24h和饥饿环境培养48h。3.营养环境或饥饿环境下,较低浓度贝伐单抗(Bev 40μg/ml)可抑制A549细胞的迁侵袭能力,且低浓度组与对照组比较差异亦均有统计学意义(均P<0.05);较高浓度贝伐单抗(Bev 160μg/ml、Bev 240μg/ml)可促进A549细胞的侵袭能力,且各处理组与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。4.结合测序结果及现有文献、基因库查找与细胞行为学改变的相关基因,营养培养环境下,Bev 160μg/ml、Bev 240μg/ml组RGC32基因表达量均较对照组上调。5.在营养培养环境下贝伐单抗处理24h或48h后,与对照组NC相比,Bev160μg/ml组、Bev 240μg/ml组的G0/G1期、S期、G2/M期差异均无统计学意义(均P>0.05);在饥饿培养环境下贝伐单抗处理24h后,各处理组的细胞周期亦无明显改变(均P>0.05);饥饿培养环境下贝伐单抗处理48h后,与对照组相比,Bev 160μg/ml组细胞周期无明显改变(均P>0.05),Bev 240μg/ml组的G0/G1期细胞比例增加(P=0.012),但是与对照组比较,Bev 240μg/ml组S期、G2/M期差异均无统计学意义(均P>0.05)。6.(1)营养培养环境下,与对照组相比,较低浓度贝伐单抗处理组(Bev40μg/ml组)RGC32 RNA表达量无明显变化(P=0.638);较高浓度组(Bev160μg/ml组、Bev 240μg/ml组)RNA表达量明显升高,且差异均有统计学意义(分别为P<0.001,P=0.013)。(2)营养培养环境下,与对照组相比,E109 2μmol/ml组、E109 8μmol/ml组、E109 16μmol/ml组RGC32 RNA表达量均无明显变化(均P>0.05)。7.(1)营养培养环境下,与对照组相比,较低浓度贝伐单抗处理组(Bev40μg/ml组)RGC32蛋白、MMP-2蛋白、N-cadherin蛋白表达量均下降,但差异均无统计学意义(分别为P=0.070,P=0.291,P=0.185),VEFD-A蛋白表达无明显变化(P=0.796);较高浓度组(Bev 160μg/ml组、Bev 240μg/ml组)RGC32蛋白、VEGF-A蛋白、MMP-2蛋白、N-cadherin蛋白表达量均升高,且差异均有统计学意义(均P<0.05)。(2)营养培养环境下,E109作用于A549细胞24h后,与对照组相比,E109 2μmol/ml组、E109 8μmol/ml组、E109 16μmol/ml组RGC32蛋白表达量均下降,(均P<0.001);E109 2μmol/ml组、E109 8μmol/ml组MMP-2蛋白表达量升高,E109 16μmol/ml组MMP-2蛋白表达量明显降低(均P<0.001);E1092μmol/ml组N-cadherin蛋白表达量增加,E109 8μmol/ml组、E109 16μmol/ml组N-cadherin蛋白表达量降低,且差异均有统计学意义(均P<0.001)。8.与仅用贝伐单抗处理组相比,PDTC和贝伐单抗同时处理组RGCC蛋白、MMP-2蛋白表达量下降。结论:1.营养和饥饿培养环境下,E109均能够抑制A549细胞的增殖,且具有一定的浓度依赖性和时间依赖性,而贝伐单抗对A549细胞增殖的抑制作用没有浓度和时间依赖性。2.营养和饥饿培养环境下,较高浓度贝伐单抗均可促进A549细胞迁移、侵袭能力;较高浓度贝伐单抗诱导的A549细胞发生EMT改变,可能由肿瘤细胞VEGF-VEGFR自分泌环引起,也可能由RGC32上调引起,或者是二者的共同作用的结果;NF-κB的抑制剂PDTC能够抑制这种改变。当然,贝伐单抗诱导肿瘤细胞EMT改变的具体机制上需要进一步验证。3.营养和饥饿培养环境下,E109能够抑制A549细胞的迁移能力;营养培养环境下,加大E109作用浓度能够抑制A549细胞发生EMT改变。E109抑制肿瘤细胞EMT改变的具体机制需要进一实验探索。