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目的应用CRISPR技术构建MT2基因缺陷鼠(MT2-/-)。用标准内毒耐受程序处理MT2-/-小鼠和野生型小鼠。观察内毒素攻击时两组小鼠血清炎症因子水平、肝脏病理性损伤的差异,以及小鼠肝细胞内p38蛋白激酶的磷酸化情况,探讨MT2对内毒素耐受现象的影响及作用机制,为进一步认识MT2的抗炎作用机制及脓毒症治疗方法提供实验依据。方法1.MT2-/-小鼠的构建利用CRISPR/Cas9技术获得杂合子MT2+/-小鼠(委托南方模式生物技术公司完成),通过杂交和回交(遗传背景均为C57BL/6J)获得子代,应用PCR方法、WB法及基因测序验证小鼠基因型,获得足够数量的MT2-/-小鼠与野生型小鼠用于后续实验。2.内毒素耐受实验挑选6-8周龄不同基因型小鼠,雌雄对半,按照随机数字法分为:野生型对照组(WT Ctrl组)、MT2-/-对照组(MT2-/-Ctrl组)、野生型高剂量LPS刺激组(WT LPS组)、MT2-/-高剂量LPS刺激组(MT2-/-LPS组)、野生型耐受组(WT ET组)、MT2-/-内毒素耐受组(MT2-/-ET组),观察每组小鼠生存状态及存活数目,记录并分析。3.内毒素耐受效应观察重复前述内毒素耐受程序,条件同前,高剂量内毒素(50 mg/kg)刺激小鼠后12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d的6个时间节点,分别取外周血,ELISA测定炎症因子(TNF-α、IL-10)水平及丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量;内毒素耐受组小鼠高剂量内毒素(50 mg/kg)刺激处理后第5 d,剖取肝组织,ELISA测定肝组织匀浆中丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)值,HE染色观察肝组织病理损伤情况,TUNEL法计算肝细胞凋亡指数;蛋白印记法及免疫组化法检测不同基因型内毒素耐受的小鼠肝脏中p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化水平。结果1.经过PCR、WB及基因测序验证,MT2敲基因小鼠构建成功;2.MT2敲基因小鼠及野生型小鼠均产生内毒素耐受现象,MT2敲基因小鼠需要5d从内毒素打击中恢复正常,野生型小鼠需要3 d即可恢复常态;高剂量内毒素打击后,MT2-/-LPS组小鼠死亡多集中在36 h内,WT LPS组集中在48 h以内;比较同一时间节点,MT2敲基因小鼠死亡率高(P<0.05);3.MT2-/-ET组小鼠促炎因子TNF-α水平和ALT含量高于WT ET组(P<0.05),且出现峰值时间短,而抗炎因子IL-10水平低于WT ET组,差异有统计学意义;4.MT2-/-ET组小鼠血清脂质过氧化产物(MDA)的水平与对照组对比明显升高(P<0.001),抗氧化酶(SOD)活性明显降低(P<0.001),WT ET组MDA水平低于MT2-/-ET组(P<0.05);5.MT2-/-ET组小鼠肝脏病理性损伤重、凋亡小体多、p38 MAPK信号通路的磷酸化水平高(P<0.05vs.WT ET组)。结论成功构建MT2-/-小鼠,MT2缺失的小鼠仍可产生内毒素耐受,但被高剂量内毒素打击后需要更长的时间恢复;MT2能抑制内毒素耐受小鼠促炎因子TNF-α释放,促进抗炎因子IL-10释放;同时MT2可能通过减少肝脏组织中p-p38蛋白的表达,减轻肝脏的病理性损伤,MT2发挥抗炎作用可能与抑制p38MAPK信号通路有关。