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研究背景:
结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)的发病率和死亡率已上升至全球恶性肿瘤的第三位，其预后较差，死亡率高。CRC的发生发展涉及多种机制，包括肠道菌群紊乱、遗传、基因突变和肠道炎症等，且其形成与发展过程中伴随着大量的原癌基因激活和抑制基因失活。目前，CRC最有效的治疗方法是以外科手术切除为主，辅以放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等。虽然辅助药物显著改善了晚期CRC患者的预后，但仅对15-25％的患者有疗效。此外，在能够接受外科手术切除的患者中，约有20％的患者术后5年内出现局部或远处复发。因此，寻找与CRC发展相关的致癌基因对进一步改进CRC的治疗、改善CRC患者的预后至关重要。
Mex3RNA结合蛋白家族成员A(Mex3a)最初发现于秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans，Celegans)中，是一种翻译调节蛋白，有助于维持生殖系统的全能性，在人类中，Mex3家族有四个同源蛋白Mex3a、b、c和d。有研究表明Mex3a在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱尿路上皮癌、Wilms肿瘤和多形性胶质母细胞瘤中起关键致癌作用。在肠道中，多项研究表明Mex3a主要影响肠道分化、极性和干性，有助于维持肠道稳态。这促使我们研究Mex3a在CRC中的作用和调控机制。
微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-23个核苷酸组成的短链非编码RNA。miRNAs通过与靶基因mRNA的3非翻译区(3-UTR)序列特异性相互作用而抑制靶基因表达，导致mRNA降解和抑制蛋白翻译。大量研究表明miRNAs在肿瘤的分化、侵袭、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。越来越多的miRNAs与CRC发生有关，并被认为是CRC预后和治疗的标记物。例如，miR-214通过调节成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)抑制CRC的生长和肝转移。miR-143、miR-18a*、miR-145均可通过抑制增殖核心信号通路MAP激酶途径的一个关键蛋白RAS的表达而抑制CRC的发生发展。因此，我们拟进一步探究与Mex3a表达相关的miRNA在CRC增殖调控中的作用。
本研究首先在人CRC临床样本中检测Mex3a的表达情况，然后通过公共数据库进一步验证了Mex3a的表达情况，随后，分析其与CRC临床病理参数的关系。接着，通过体、内外功能实验探索Mex3a对CRC细胞增殖、侵袭、迁移等能力的影响，并通过寻找与Mex3a直接结合的miRNA，探究其调控的下游信号通路，为CRC发病机制提供新的视角。
研究方法:
1.通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)发现，相比于癌旁组织，CRC组织中Mex3a蛋白表达水平明显上调，同样Westernblot也证实了该蛋白在癌和癌旁中的表达情况，随后使用高通量基因表达数据库(gene expression omnibus，GEO)和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库再次验证了Mex3a在癌和癌旁组织中的表达情况。根据IHC的打分结果，分析Mex3a的表达与CRC患者临床病理特征的关系。对CRC患者的随访资料整理分析，通过Kaplan-Meier法绘制出Mex3a的表达与CRC患者生存率的关系。
2.通过实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及Westernblot检测Mex3a在CRC细胞系中的表达，筛选出内源性高、低表达Mex3a的细胞系。选择高表达Mex3a的细胞系SW620和SW480转染Mex3a小干扰。选择Mex3a低表达的细胞系HCT116转染Mex3a过表达质粒。通过5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2-deoxyuridine，EDU)、血管形成、化疗药物敏感性和Transwell实验分别检测Mex3a对CRC细胞增殖能力、血管形成能力、化疗药物敏感性、侵袭和迁移能力的影响。
3.采用慢病毒构建稳定敲低Mex3a的SW620和SW480细胞系及稳定过表达Mex3a的HCT116细胞系，将经过嘌呤霉素筛选后的Mex3a稳定敲低及过表达的CRC细胞系及对照细胞系，通过皮下注射接种到裸鼠体内，观察Mex3a对CRC细胞体能成瘤能力的影响。
4.通过转录组学测序及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，KEGG)分析筛选出Mex3a影响CRC发展的下游信号通路:RAP1GTPase激活蛋白(RAP1 GTPase activating protein，RAP1 GAP)/丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)/缺氧诱导因子1亚单位α(hypoxia-induciblefactor1subunitalpha，HIF-1α)，并通过Westernblot探究了Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α信号通路的影响。采用MEK抑制剂(U0126)检测Mex3a是否通过MEK/ERK/HIF-1α信号通路影响CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。通过Westernblot检测使用U0126后，RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的变化。
5.通过蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)检测Mex3a与RAPIGAP的相互作用。通过对CRC组织及癌旁组织进行IHC染色及打分，探究Mex3a和RAP1GAP在CRC中的表达情况及两者的相关性。利用TCGA数据库进一步验证RAP1GAP在CRC组织和癌旁组织中的表达情况，并通过Kaplan-Meier法分析RAP1GAP的表达与CRC患者生存时间的关系。通过Westernblot实验证明RAP1GAP可以逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路的影响。
6.通过TargetScan(www.targetscan.org)和miRDB(mirdb.org)预测调控Mex3a的miRNA，并得到hsa-miR-6887-3p在Mex3amRNA3-UTR上的结合位点及突变位点序列。通过荧光素酶报告基因实验检测hsa-miR-6887-3p对Mex3amRNA3-UTR的荧光素酶活性的影响。通过TCGA数据库验证hsa-miR-6887-3p在CRC组织和癌旁组织中的表达情况，并通过Kaplan-Meier法分析hsa-miR-6887-3p的表达与CRC患者生存时间的关系。通过qRT-PCR检测hsa-miR-6887-3p在CRC细胞系中的表达，筛选出内源性低表达hsa-miR-6887-3p和高表达hsa-miR-6887-3p的细胞系。选择高表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系HCT116转染hsa-miR-6887-3pinhibitor，选择低表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系SW620转染hsa-miR-6887-3pmimics，并通过qRT-PCR检测hsa-miR-6887-3pmRNA表达情况。通过qRT-PCR及Westernblot检测hsa-miR-6887-3p对Mex3amRNA及蛋白表达水平的影响。
7.通过Westernblot检测在SW620细胞系中转染Mex3a小干扰、过表达hsa-miR-6887-3p及Mex3a后，对SW620细胞株中Mex3a表达的影响。通过功能性回复实验探究了hsa-miR-6887-3p对CRC细胞体外增殖和侵袭能力的影响。
8.采用慢病毒构建稳定过表达hsa-miR-6887-3p的SW620细胞系，将经过嘌呤霉素筛选后的稳定过表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系及对照细胞系，通过皮下注射接种到裸鼠体内，观察hsa-miR-6887-3p在体内条件下对CRC细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。
结果:
1.Mex3a在CRC组织中高表达且与临床不良预后相关
通过IHC染色分析101例CRC组织和79个正常癌旁组织中Mex3a的蛋白表达水平，结果显示CRC组织中Mex3a高表达，而在癌旁组织中Mex3a几乎不表达。通过Westernblot检测Mex3a的蛋白表达情况，发现Mex3a在CRC组织中的蛋白表达水平高于邻近癌旁组织。通过GEO(GSE39582数据集)和TCGA数据库发现在CRC组织中Mex3amRNA的表达明显高于癌旁组织。根据101例CRC患者的随访资料进行临床病理参数相关性分析显示，在CRC组织中，Mex3a的高表达与T分期(P=0.025)、病理分级(P=0.035)及患者的存活状态(P=0.012)等临床病理参数呈正相关，而与年龄(P=0.134)、性别(P=0.392)、N分期(P=0.919)、M分期(P=1)及TNM等级(P=0.325)无明显相关性。Kaplan-Meier生存分析发现，在101例CRC患者中，与Mex3a低表达组相比，高表达Mex3a患者组总生存率(OS)明显降低(P=0.003)。其次，对GSE39582数据集进行生存分析也发现，与Mex3a低表达患者相比，高表达Mex3a的CRC患者组OS明显缩短(P=0.022)，无复发存活率(RFS)也明显降低(P=0.048)。
2.Mex3a促进CRC细胞的致瘤特性
qRT-PCR及Westernblot结果显示Mex3a在CRC细胞系SW620和SW480中表达相对较高，在HCT116细胞系中表达相对较低。Westernblot结果显示，与对照组相比，转染Mex3a小干扰(Mex3a siRNA)和过表达质粒(Mex3a-flag)组与对照组相比，分别能够有效降低和增加Mex3a在CRC细胞中的表达。
EDU实验表明，干扰Mex3a表达后CRC细胞增殖能力明显减弱，而过表达Mex3a后，CRC细胞的增殖能力则显著增强。血管形成实验表明，干扰Mex3a表达后CRC细胞促进血管形成能力明显减弱，而过表达Mex3a后，CRC细胞促进血管形成能力增强。Tanswell结果表明，干扰Mex3a表达可抑制CRC细胞的侵袭和迁移能力，而过表达Mex3a则显著促进CRC细胞的侵袭和迁移能力。化疗药物敏感性实验显示，干扰Mex3a后CRC细胞抗化疗药物能力明显减弱，而过表达Mex3a后，CRC细胞抗化疗药物能力增强。
3.Mex3a促进CRC细胞体内成瘤能力
首先构建Mex3a稳定敲低(Mex3a KD)和对照(Control KD)CRC细胞株，Mex3a稳定过表达(OE Mex3a)和对照(OE Control)CRC细胞株。并用稳定转染的细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，结果显示Mex3aKD种植细胞组，肿瘤体积和瘤重显著小于对照细胞组。Ki-67染色显示，Mex3aKD种植细胞组，Ki-67阳性细胞数显著少于对照细胞组，表明敲低Mex3a后肿瘤细胞的增殖能力显著降低。而OEMex3a种植细胞组肿瘤体积、瘤重及Ki-67染色则有相反的结果。
4.Mex3a为CRC细胞中RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α信号通路的激活因子
通过对稳定转染的SW480Mex3aKD及SW480ControlKDCRC细胞株进行转录组学测序来寻找Mex3a的下游靶基因和相关信号通路，结果显示敲低Mex3a引起MAPK和Rap1在内的众多信号通路发生改变。考虑到参与该通路的差异表达基因，我们推测Mex3a可能通过RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路影响CRC表型。Westernblot结果显示，与对照组相比，在SW620和SW480细胞系中敲低Mex3a后，RAP1GAP蛋白表达水平显著升高，p-MEK1/2、p-ERK1/2及HIF-1α蛋白表达水平显著降低。功能性回复实验显示，MEK抑制剂U0126可以逆转Mex3a对CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力的促进作用。Westernblot结果显示，U0126可逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的影响。
5.RAP1GAP是CRC细胞中Mex3a的下游靶基因
Co-IP检测发现，CRC细胞中Mex3a可与RAP1GAP相互作用。对100例CRC组织和6例癌旁组织进行IHC染色，分析Mex3a及RAP1GAP的蛋白表达情况，结果显示在CRC组织中Mex3a高表达，而RAP1GAP则在CRC组织中低表达，且RAP1GAP与Mex3a的表达负相关。Westernblot结果显示，RAP1GAP可逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的影响。通过TCGA数据库发现，CRC组织中RAP1GAPmRNA的表达水平明显低于癌旁组织，且Kaplan-Meier生存曲线分析显示，与高表达RAP1GAP的CRC患者组相比，RAP1GAP低表达的CRC患者组OS明显缩短(P=0.032)。
6.hsa-miR-6887-3p是CRC细胞中Mex3a的上游靶点
通过TargetScan和miRDB预测调控Mex3a的miRNA，并得到其在Mex3amRNA3-UTR上的结合位点及突变位点序列，荧光素酶报告基因实验显示过表达hsa-miR-6887-3p能够显著减弱Mex3amRNA非突变端3-UTR(3-UTR WT)的荧光素酶活性。通过Starbase(starbase.sysu.edu.cn)分析发现，与肿瘤周围正常组织相比，hsa-miR-6887-3p在CRC组织中低表达。且Kaplan-Meier生存分析结果显示，与高表达hsa-miR-6887-3p患者组相比，hsa-miR-6887-3p低表达组患者生存时间明显缩短(P=0.047)。
qRT-PCR检测发现hsa-miR-6887-3p在SW620中相对低表达，在HCT116细胞系中相对高表达。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，转染hsa-miR-6887-3pmimics组和hsa-miR-6887-3pinhibitor分别能够有效地增加和降低CRC细胞中hsa-miR-6887-3p的表达。qRT-PCR及Westernblot检测结果显示，hsa-miR-6887-3p能够调控CRC细胞中Mex3a的mRNA及蛋白表达水平。
7.hsa-miR-6887-3p通过抑制Mex3a的表达而抑制CRC细胞的致瘤特性
Westernblot结果显示，过表达Mex3a可以逆转hsa-miR-6887-3p对Mex3a的抑制作用。EDU和基质胶Transwell检测结果表明，过表达hsa-miR-6887-3p组与干扰Mex3a表达组均可抑制CRC细胞的增殖和侵袭，且同时过表达Mex3a和hsa-miR-6887-3p组可以逆转过表达hsa-miR-6887-3p对CRC细胞的增殖和侵袭能力的抑制作用。在HCT116细胞中进行的反向验证也证明了以上结论。
8.hsa-miR-6887-3p抑制CRC细胞的体内成瘤能力
构建hsa-miR-6887-3p稳定过表达(LV-miR-6887-3p)组和对照(LV-miR-NC)组CRC细胞株，并用稳定转染的CRC细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型，结果显示LV-miR-6887-3p种植细胞组，肿瘤体积和瘤重均小于对照细胞组。Ki-67染色显示，与对照组相比，LV-miR-6887-3p种植细胞组肿瘤细胞的增殖能力显著减弱。
结论:
1.Mex3a在CRC中表达量增高且与临床不良预后相关。
2.体内、外实验表明Mex3a提高CRC细胞的恶性生物学行为。
3.RAP1GAP是Mex3a的下游靶分子，可逆转Mex3a对MEK/ERK/HIF-1α信号通路活性的影响。
4.hsa-miR-6887-3p通过调控Mex3a的表达，抑制CRC细胞的生物学行为。
结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)的发病率和死亡率已上升至全球恶性肿瘤的第三位，其预后较差，死亡率高。CRC的发生发展涉及多种机制，包括肠道菌群紊乱、遗传、基因突变和肠道炎症等，且其形成与发展过程中伴随着大量的原癌基因激活和抑制基因失活。目前，CRC最有效的治疗方法是以外科手术切除为主，辅以放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等。虽然辅助药物显著改善了晚期CRC患者的预后，但仅对15-25％的患者有疗效。此外，在能够接受外科手术切除的患者中，约有20％的患者术后5年内出现局部或远处复发。因此，寻找与CRC发展相关的致癌基因对进一步改进CRC的治疗、改善CRC患者的预后至关重要。
Mex3RNA结合蛋白家族成员A(Mex3a)最初发现于秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans，Celegans)中，是一种翻译调节蛋白，有助于维持生殖系统的全能性，在人类中，Mex3家族有四个同源蛋白Mex3a、b、c和d。有研究表明Mex3a在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱尿路上皮癌、Wilms肿瘤和多形性胶质母细胞瘤中起关键致癌作用。在肠道中，多项研究表明Mex3a主要影响肠道分化、极性和干性，有助于维持肠道稳态。这促使我们研究Mex3a在CRC中的作用和调控机制。
微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-23个核苷酸组成的短链非编码RNA。miRNAs通过与靶基因mRNA的3非翻译区(3-UTR)序列特异性相互作用而抑制靶基因表达，导致mRNA降解和抑制蛋白翻译。大量研究表明miRNAs在肿瘤的分化、侵袭、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。越来越多的miRNAs与CRC发生有关，并被认为是CRC预后和治疗的标记物。例如，miR-214通过调节成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)抑制CRC的生长和肝转移。miR-143、miR-18a*、miR-145均可通过抑制增殖核心信号通路MAP激酶途径的一个关键蛋白RAS的表达而抑制CRC的发生发展。因此，我们拟进一步探究与Mex3a表达相关的miRNA在CRC增殖调控中的作用。
本研究首先在人CRC临床样本中检测Mex3a的表达情况，然后通过公共数据库进一步验证了Mex3a的表达情况，随后，分析其与CRC临床病理参数的关系。接着，通过体、内外功能实验探索Mex3a对CRC细胞增殖、侵袭、迁移等能力的影响，并通过寻找与Mex3a直接结合的miRNA，探究其调控的下游信号通路，为CRC发病机制提供新的视角。
研究方法:
1.通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)发现，相比于癌旁组织，CRC组织中Mex3a蛋白表达水平明显上调，同样Westernblot也证实了该蛋白在癌和癌旁中的表达情况，随后使用高通量基因表达数据库(gene expression omnibus，GEO)和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库再次验证了Mex3a在癌和癌旁组织中的表达情况。根据IHC的打分结果，分析Mex3a的表达与CRC患者临床病理特征的关系。对CRC患者的随访资料整理分析，通过Kaplan-Meier法绘制出Mex3a的表达与CRC患者生存率的关系。
2.通过实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及Westernblot检测Mex3a在CRC细胞系中的表达，筛选出内源性高、低表达Mex3a的细胞系。选择高表达Mex3a的细胞系SW620和SW480转染Mex3a小干扰。选择Mex3a低表达的细胞系HCT116转染Mex3a过表达质粒。通过5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2-deoxyuridine，EDU)、血管形成、化疗药物敏感性和Transwell实验分别检测Mex3a对CRC细胞增殖能力、血管形成能力、化疗药物敏感性、侵袭和迁移能力的影响。
3.采用慢病毒构建稳定敲低Mex3a的SW620和SW480细胞系及稳定过表达Mex3a的HCT116细胞系，将经过嘌呤霉素筛选后的Mex3a稳定敲低及过表达的CRC细胞系及对照细胞系，通过皮下注射接种到裸鼠体内，观察Mex3a对CRC细胞体能成瘤能力的影响。
4.通过转录组学测序及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，KEGG)分析筛选出Mex3a影响CRC发展的下游信号通路:RAP1GTPase激活蛋白(RAP1 GTPase activating protein，RAP1 GAP)/丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)/缺氧诱导因子1亚单位α(hypoxia-induciblefactor1subunitalpha，HIF-1α)，并通过Westernblot探究了Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α信号通路的影响。采用MEK抑制剂(U0126)检测Mex3a是否通过MEK/ERK/HIF-1α信号通路影响CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。通过Westernblot检测使用U0126后，RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的变化。
5.通过蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)检测Mex3a与RAPIGAP的相互作用。通过对CRC组织及癌旁组织进行IHC染色及打分，探究Mex3a和RAP1GAP在CRC中的表达情况及两者的相关性。利用TCGA数据库进一步验证RAP1GAP在CRC组织和癌旁组织中的表达情况，并通过Kaplan-Meier法分析RAP1GAP的表达与CRC患者生存时间的关系。通过Westernblot实验证明RAP1GAP可以逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路的影响。
6.通过TargetScan(www.targetscan.org)和miRDB(mirdb.org)预测调控Mex3a的miRNA，并得到hsa-miR-6887-3p在Mex3amRNA3-UTR上的结合位点及突变位点序列。通过荧光素酶报告基因实验检测hsa-miR-6887-3p对Mex3amRNA3-UTR的荧光素酶活性的影响。通过TCGA数据库验证hsa-miR-6887-3p在CRC组织和癌旁组织中的表达情况，并通过Kaplan-Meier法分析hsa-miR-6887-3p的表达与CRC患者生存时间的关系。通过qRT-PCR检测hsa-miR-6887-3p在CRC细胞系中的表达，筛选出内源性低表达hsa-miR-6887-3p和高表达hsa-miR-6887-3p的细胞系。选择高表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系HCT116转染hsa-miR-6887-3pinhibitor，选择低表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系SW620转染hsa-miR-6887-3pmimics，并通过qRT-PCR检测hsa-miR-6887-3pmRNA表达情况。通过qRT-PCR及Westernblot检测hsa-miR-6887-3p对Mex3amRNA及蛋白表达水平的影响。
7.通过Westernblot检测在SW620细胞系中转染Mex3a小干扰、过表达hsa-miR-6887-3p及Mex3a后，对SW620细胞株中Mex3a表达的影响。通过功能性回复实验探究了hsa-miR-6887-3p对CRC细胞体外增殖和侵袭能力的影响。
8.采用慢病毒构建稳定过表达hsa-miR-6887-3p的SW620细胞系，将经过嘌呤霉素筛选后的稳定过表达hsa-miR-6887-3p的CRC细胞系及对照细胞系，通过皮下注射接种到裸鼠体内，观察hsa-miR-6887-3p在体内条件下对CRC细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。
结果:
1.Mex3a在CRC组织中高表达且与临床不良预后相关
通过IHC染色分析101例CRC组织和79个正常癌旁组织中Mex3a的蛋白表达水平，结果显示CRC组织中Mex3a高表达，而在癌旁组织中Mex3a几乎不表达。通过Westernblot检测Mex3a的蛋白表达情况，发现Mex3a在CRC组织中的蛋白表达水平高于邻近癌旁组织。通过GEO(GSE39582数据集)和TCGA数据库发现在CRC组织中Mex3amRNA的表达明显高于癌旁组织。根据101例CRC患者的随访资料进行临床病理参数相关性分析显示，在CRC组织中，Mex3a的高表达与T分期(P=0.025)、病理分级(P=0.035)及患者的存活状态(P=0.012)等临床病理参数呈正相关，而与年龄(P=0.134)、性别(P=0.392)、N分期(P=0.919)、M分期(P=1)及TNM等级(P=0.325)无明显相关性。Kaplan-Meier生存分析发现，在101例CRC患者中，与Mex3a低表达组相比，高表达Mex3a患者组总生存率(OS)明显降低(P=0.003)。其次，对GSE39582数据集进行生存分析也发现，与Mex3a低表达患者相比，高表达Mex3a的CRC患者组OS明显缩短(P=0.022)，无复发存活率(RFS)也明显降低(P=0.048)。
2.Mex3a促进CRC细胞的致瘤特性
qRT-PCR及Westernblot结果显示Mex3a在CRC细胞系SW620和SW480中表达相对较高，在HCT116细胞系中表达相对较低。Westernblot结果显示，与对照组相比，转染Mex3a小干扰(Mex3a siRNA)和过表达质粒(Mex3a-flag)组与对照组相比，分别能够有效降低和增加Mex3a在CRC细胞中的表达。
EDU实验表明，干扰Mex3a表达后CRC细胞增殖能力明显减弱，而过表达Mex3a后，CRC细胞的增殖能力则显著增强。血管形成实验表明，干扰Mex3a表达后CRC细胞促进血管形成能力明显减弱，而过表达Mex3a后，CRC细胞促进血管形成能力增强。Tanswell结果表明，干扰Mex3a表达可抑制CRC细胞的侵袭和迁移能力，而过表达Mex3a则显著促进CRC细胞的侵袭和迁移能力。化疗药物敏感性实验显示，干扰Mex3a后CRC细胞抗化疗药物能力明显减弱，而过表达Mex3a后，CRC细胞抗化疗药物能力增强。
3.Mex3a促进CRC细胞体内成瘤能力
首先构建Mex3a稳定敲低(Mex3a KD)和对照(Control KD)CRC细胞株，Mex3a稳定过表达(OE Mex3a)和对照(OE Control)CRC细胞株。并用稳定转染的细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，结果显示Mex3aKD种植细胞组，肿瘤体积和瘤重显著小于对照细胞组。Ki-67染色显示，Mex3aKD种植细胞组，Ki-67阳性细胞数显著少于对照细胞组，表明敲低Mex3a后肿瘤细胞的增殖能力显著降低。而OEMex3a种植细胞组肿瘤体积、瘤重及Ki-67染色则有相反的结果。
4.Mex3a为CRC细胞中RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α信号通路的激活因子
通过对稳定转染的SW480Mex3aKD及SW480ControlKDCRC细胞株进行转录组学测序来寻找Mex3a的下游靶基因和相关信号通路，结果显示敲低Mex3a引起MAPK和Rap1在内的众多信号通路发生改变。考虑到参与该通路的差异表达基因，我们推测Mex3a可能通过RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路影响CRC表型。Westernblot结果显示，与对照组相比，在SW620和SW480细胞系中敲低Mex3a后，RAP1GAP蛋白表达水平显著升高，p-MEK1/2、p-ERK1/2及HIF-1α蛋白表达水平显著降低。功能性回复实验显示，MEK抑制剂U0126可以逆转Mex3a对CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力的促进作用。Westernblot结果显示，U0126可逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的影响。
5.RAP1GAP是CRC细胞中Mex3a的下游靶基因
Co-IP检测发现，CRC细胞中Mex3a可与RAP1GAP相互作用。对100例CRC组织和6例癌旁组织进行IHC染色，分析Mex3a及RAP1GAP的蛋白表达情况，结果显示在CRC组织中Mex3a高表达，而RAP1GAP则在CRC组织中低表达，且RAP1GAP与Mex3a的表达负相关。Westernblot结果显示，RAP1GAP可逆转Mex3a对RAP1GAP/MEK/ERK/HIF-1α通路活性的影响。通过TCGA数据库发现，CRC组织中RAP1GAPmRNA的表达水平明显低于癌旁组织，且Kaplan-Meier生存曲线分析显示，与高表达RAP1GAP的CRC患者组相比，RAP1GAP低表达的CRC患者组OS明显缩短(P=0.032)。
6.hsa-miR-6887-3p是CRC细胞中Mex3a的上游靶点
通过TargetScan和miRDB预测调控Mex3a的miRNA，并得到其在Mex3amRNA3-UTR上的结合位点及突变位点序列，荧光素酶报告基因实验显示过表达hsa-miR-6887-3p能够显著减弱Mex3amRNA非突变端3-UTR(3-UTR WT)的荧光素酶活性。通过Starbase(starbase.sysu.edu.cn)分析发现，与肿瘤周围正常组织相比，hsa-miR-6887-3p在CRC组织中低表达。且Kaplan-Meier生存分析结果显示，与高表达hsa-miR-6887-3p患者组相比，hsa-miR-6887-3p低表达组患者生存时间明显缩短(P=0.047)。
qRT-PCR检测发现hsa-miR-6887-3p在SW620中相对低表达，在HCT116细胞系中相对高表达。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，转染hsa-miR-6887-3pmimics组和hsa-miR-6887-3pinhibitor分别能够有效地增加和降低CRC细胞中hsa-miR-6887-3p的表达。qRT-PCR及Westernblot检测结果显示，hsa-miR-6887-3p能够调控CRC细胞中Mex3a的mRNA及蛋白表达水平。
7.hsa-miR-6887-3p通过抑制Mex3a的表达而抑制CRC细胞的致瘤特性
Westernblot结果显示，过表达Mex3a可以逆转hsa-miR-6887-3p对Mex3a的抑制作用。EDU和基质胶Transwell检测结果表明，过表达hsa-miR-6887-3p组与干扰Mex3a表达组均可抑制CRC细胞的增殖和侵袭，且同时过表达Mex3a和hsa-miR-6887-3p组可以逆转过表达hsa-miR-6887-3p对CRC细胞的增殖和侵袭能力的抑制作用。在HCT116细胞中进行的反向验证也证明了以上结论。
8.hsa-miR-6887-3p抑制CRC细胞的体内成瘤能力
构建hsa-miR-6887-3p稳定过表达(LV-miR-6887-3p)组和对照(LV-miR-NC)组CRC细胞株，并用稳定转染的CRC细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型，结果显示LV-miR-6887-3p种植细胞组，肿瘤体积和瘤重均小于对照细胞组。Ki-67染色显示，与对照组相比，LV-miR-6887-3p种植细胞组肿瘤细胞的增殖能力显著减弱。
结论:
1.Mex3a在CRC中表达量增高且与临床不良预后相关。
2.体内、外实验表明Mex3a提高CRC细胞的恶性生物学行为。
3.RAP1GAP是Mex3a的下游靶分子，可逆转Mex3a对MEK/ERK/HIF-1α信号通路活性的影响。
4.hsa-miR-6887-3p通过调控Mex3a的表达，抑制CRC细胞的生物学行为。