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神经红蛋白(Neuroglobin,NGB)是2000年由德国科学家Burmester,T等在人和鼠脑中发现的一种新颖的珠蛋白。相对于血红蛋白和肌红蛋白中血红素Fe的五配位形式,神经红蛋白中的血红素Fe是六配位形式。这种结构的蛋白在脊椎动物中还属于首例,新的结构必然会赋予该蛋白新的性质与功能。为研究NGB的基本化学生物学性质及金属辅基与蛋白结构和性质之间的关系,我们研究了脱辅基神经红蛋白(apoNGB)的结构和性质,并研究了锰、钴卟啉重组神经红蛋白的结构和性质,进一步研究了酯化血红素重组神经红蛋白的结构及性质。 1.分别用丁酮萃取法和酸丙酮法制备了apoNGB。用丁酮萃取法制备的apoNGB产率高(90％以上),结构稳定,但还含有一定的全蛋白;而用酸丙酮法制备的apoNGB较纯,但产率相对较低(70%左右),结构稳定性低。和NGB相比,apoNGB的色氨酸进一步暴露于极性溶剂中,α-螺旋的含量降低。 2. apoNGB的去折叠研究。apoNGB在酸中去折叠过程为:天然态(N)?部分去折叠态(UA)?熔球态(MG)。apoNGB的热变性研究表明,apoNGB和NGB的热变性中点为66.0℃和90.8℃,说明血红素辅基对蛋白的肽链具有稳定作用。尿素浓度达到9 mol·L-1时,apoNGB的肽链并没有完全伸展,主要是色氨酸逐渐暴露于极性环境中。在9 mol·L-1尿素下,荧光探针ANS结合在肽链上的疏水区域并没有完全暴露于极性溶剂中;而在4 mol·L-1盐酸胍下,此疏水区域则完全暴露于极性溶剂中。apoNGB在盐酸胍中变性完全,盐酸胍的变性能力明显高于尿素。荧光相图表明,apoNGB在盐酸胍和尿素中的去折叠过程不同。由ANS和脱辅基神经红蛋白结合的荧光光谱得到其解离常数KD=14μmol·L-1,结合部位数n为1.2。ANS-apoNGB的荧光可被1.2倍的血红素所猝灭,说明ANS结合在apoNGB的血红素区域。 3.利用UV-Vis光谱和荧光光谱研究了apoNGB与锰卟啉的结合过程。结果表明,当两者浓度相等时,反应基本到达平衡,说明apoNGB与锰卟啉以1:1的摩尔比结合。用UV-Vis光谱、荧光光谱、CD光谱、电喷雾质谱对锰卟啉重组蛋白(Mn-NGB)进行了表征。小分子配体SCN-、N3-、CN-与Mn-NGB不反应,说明Mn-NGB表现为反应较惰性。Mn-NGB的盐酸胍变性研究表明,随着蛋白肽链的去折叠,锰卟啉从肽链上脱离下来。Mn-NGB稳定性小于NGB。荧光相图表明,Mn-NGB在盐酸胍中的去折叠存在三种状态。Mn-NGB的热变性中点为74.7℃,说明Mn-NGB的热稳定性降低。因此,卟啉中锰金属的替换影响了辅基的配位环境,对蛋白质中的空间构象产生了微扰,从而导致蛋白肽链的稳定性有所下降。 4.利用UV-Vis光谱和荧光光谱研究了apoNGB与钴卟啉的结合过程。结果表明,当两者浓度相等时,反应基本到达平衡,说明apoNGB与钴卟啉以1:1的摩尔比结合。用UV-Vis光谱、荧光光谱、CD光谱对钴卟啉重组蛋白(Co-NGB)进行了表征。小分子配体SCN-、N3-与Co-NGB不反应,但CN-可反应,说明Co-NGB较Mn-NGB反应性高些。Co-NGB的盐酸胍变性研究表明,钴卟啉并没有从肽链上脱离下来。Co-NGB在盐酸胍中的去折叠符合―两态模型‖。Co-NGB盐酸胍CD变性曲线不同于NGB,说明钴金属影响了蛋白和变性剂的相互作用。Co-NGB的热变性中点为82.7℃,说明Co-NGB的热稳定性下降。Co-NGB在不同pH下的去折叠研究表明:Co-NGB在碱性条件下比较稳定;而在酸性条件下则先形成部分去折叠态,然后再形成熔球态。ANS荧光光谱表明, ANS不能和Co-NGB结合。 5.合成了氯化血红素的衍生物对甲基苯酚双酯氯化血红素和苯酚双酯氯化血红素,采用电喷雾质谱,紫外-可见吸收光谱等进行了表征。将人工合成的氯化血红素的双酯衍生物与apoNGB重组,制备得到了酯化血红素重组NGB。重组NGB的光谱表明,重组NGB的ASoret/A280值都小于NGB(3.0),重组NGB的色氨酸进一步暴露于极性环境中,说明重组NGB中卟啉和色氨酸周围的环境都发生了变化。