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研究背景和目的胃癌（Gastric Ccancer,GC）是一类直接威胁和严重影响我们人类身体健康的常见消化系统恶性肿瘤,近年来虽然针对肿瘤的治疗手段取得了很大的提高,但是中晚期胃癌的侵袭和转移仍然是导致患者术后高死亡率的主要原因。对胃癌潜在发病机制进行深入探索,并寻找新型诊断标志物与潜在治疗靶点对控制胃癌的发生及发展至关重要。环状RNA是一种常见于哺乳动物的环状非编码RNA分子,能够对基因的表达进行转录或转录后水平调控。研究表明,环状RNA可以通过直接或间接作用调控下游基因的表达水平,促进或抑制恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,参与肿瘤的生长、侵袭和转移等生物学行为。近年来大量研究表明,环状RNA与miRNA分子可通过海绵吸附的机制作用,对miRNA的功能活性产生抑制,从而在转录水平对miRNA进行调控。然而目前对胃癌进展中环状RNA发挥的功能作用及其机制的研究多数依旧停留在基因表达的检测水平,仅有为数不多的研究较为深入的涉及到环状RNA在胃癌进展中的功能与作用机制。本研究首先运用高通量测序技术检测了 MNNG诱导之后发生恶转的正常胃上皮粘膜细胞株和未经处理的细胞株中全转录基因组表达谱,寻找出具有差异表达的circRNA,并探究其在胃癌中的作用及机制,拟发掘胃癌的潜在标志物,为胃癌的靶向治疗提供新的靶点和理论与数据积累。研究方法1.选取前期用MNNG处理之后发生恶转的胃上皮粘膜细胞GES-1-T和阴性对照的正常胃上皮粘膜细胞株GES-1-N进行环状RNA的全转录组高通量测序检测,初步筛选出具有明显差异表达的环状RNA,运用qRT-PCR方法在胃癌组织和细胞中对筛选出的环状RNA hsa＿circ＿006100进行实验检测,并通过分析发现hsa＿circ＿006100的表达改变与胃癌不同时期肿瘤患者的临床病理学特征之间的相互关系。2.用质粒过表达hsa＿circ＿006100后,在胃癌细胞株AGS和MGC-803中使用CCK-8和克隆形成实验检测hsa＿circ＿006100过表达后胃癌细胞增殖水平的变化,使用Hoechst染色实验检测hsa＿circ＿006100对胃癌细胞凋亡水平的影响,使用Transwell实验检测hsa＿circ＿006100对于胃癌细胞迁移及其侵袭的影响。3.使用Targetscan、RegRNA和miRanda等多个生物信息学软件对hsa＿circ＿006100可能联系的miRNA进行预测,运用双荧光素酶报告实验对预测出来hsa＿circ＿006100调节的miRNA进一步分析验证。通过qRT-PCR实验方法对miR-195的表达进行检测,并分析其表达改变与胃癌不同时期肿瘤患者的临床病理学特征之间的相互关系。将hsa＿circ＿006100过表达质粒和miR-195mimics共同转染到胃癌细胞株之后,采用CCK-8、克隆形成实验、Hoechst染色实验和Transwell实验研究两者之间是否存在相互作用及胃癌细胞功能的改变。4.使用miRanda,Pictar和Targetscan等多个生物信息学预测软件对miR-195可能作用的靶基因进行分析预测,运用双荧光素酶报告实验和多个细胞功能学相关实验进一步研究分析miR-195对于GPRC5A的靶向作用。5.最后通过裸鼠成瘤实验证实hsa＿circ＿006100在体内对胃癌的作用。结果1.环状RNA高通量基因测序检测MNNG诱导之后恶性转化的胃粘膜上皮细胞株GES-1-T和未经恶转的正常胃黏膜上皮细胞株GES-1-N共发现4650个环状RNA的表达具有明显的差异性,其中在GES-1-T中呈相对升高的1509个,在GES-1-T细胞中相对表达降低的3141个。根据在胃癌组织和多种胃癌细胞株中的qRT-PCR实验验证结果,选择表达上调最明显的hsa＿circ＿006100作为研究对象。且hsa＿circ＿006100与恶性肿瘤的分化水平、胃癌患者的TNM分期及淋巴结转移具有有显著相关性。2.CCK-8和克隆形成实验表明,较之阴性对照组,hsa＿circ＿006100过表达的胃癌细胞株MGC-803和AGS增殖能力增强,差异具有统计学意义（P<0.05）;Hoechst染色实验表明,hsa＿circ＿006100过表达的胃癌细胞株MGC-803和AGS凋亡率减少,Transwell实验表明hsa＿circ＿006100过表达的胃癌细胞株MGC-803和AGS迁移和侵袭能力均得到增强。3.生物信息学软件结合文献分析预测hsa＿circ＿006100的相结合的靶miRNA发现 miR-1236-5p、miR-195、miR-1236-3p、miR-10a-5p、miR-107 和胃癌进展具有相关性,qRT-PCR实验检测hsa＿circ＿006100表达被干扰时胃癌细胞株MGC-803中5个候选miRNA的表达水平变化,结果显示hsa＿circ＿006100对miR-195表达改变的影响最明显。双荧光素酶报告基因证实hsa＿circ＿006100与miR-195之间存在结合位点,hsa＿circ＿006100过表达时能够抑制miR-195在胃癌细胞株MGC-803和AGS的表达量。且miR-195低表达的胃癌患者具有细胞分化程度较差、肿瘤TNM分期较晚和淋巴结转移率高等特点。CCK-8和克隆形成实验结果显示,与阴性对照组相比较,在胃癌细胞株MGC-803和AGS中miR-195模拟物可以部分逆转由于hsa＿circ＿006100过表达所致的促进增殖作用,Hoechst染色实验结果显示,在胃癌细胞株MGC-803和AGS中miR-195模拟物可以部分逆转由于hsa＿circ＿006100过表达所致的抑制凋亡作用,Transwell实验结果显示,在胃癌细胞株MGC-803和AGS中miR-195模拟物可以部分逆转由于hsa＿circ＿006100过表达所致的促进迁移和侵袭作用。4.qRT-PCR实验检测miR-195过表达的胃癌细胞株MGC-803中生物信息学软件预测的5个肿瘤相关mRNA WNT3A、GDPD5、CHEK1、NOTCH2、GPRC5A的表达变化,结果显示GPRC5A受miR-195的影响最明显。双荧光素酶报告基因证实miR-195与GPRC5A之间存在结合位点。GPRC5A在胃癌组织中的相对癌旁正常组织表达水平明显升高。在胃癌组织和胃癌细胞株中GPRC5A与miR-195的表达为负性相关。CCK-8和克隆形成实验结果显示,上调miR-195的表达后,能够逆转GPRC5A上调导致的增殖促进作用;Hoechst染色实验显示,上调miR-195的表达后,能够逆转GPRC5A上调导致的凋亡抑制作用;Transwell实验结果显示,上调miR-195的表达后,能够逆转GPRC5A上调导致的迁移和侵袭促进作用。5.在裸鼠成瘤实验中,hsa＿circ＿006100表达沉默的MGC-803组异种移植肿瘤体积和重量较对照组缩小,抑制miR-195的表达使异种移植肿瘤体积和重量缩小得到逆转。HE染色结果显示hsa＿circ＿006100低表达和miR-195过表达时肿瘤微血管数量减少,免疫组化结果显示hsa＿circ＿006100表达沉默PCNA染色减弱,western blot 结果显示 hsa＿circ＿006100 表达沉默,Bcl-2,GPRC5A,EGFR,E-cadherin,N-cadherin 表达减弱,Cleaved Caspase3 表达增强,抑制miR-195 的表达部分逆转hsa＿circ＿006100导致的表达改变。结论hsa＿circ＿006100在胃癌组织和细胞中表达呈高表达,能够显著促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT功能,hsa＿circ＿006100可与miR-195结合发挥ceRNA作用,GPRC5A在胃癌组织中表达显著上调,可与miR-195靶向结合。本研究首次发现hsa＿circ＿006100通过竞争性结合miR-195间接调节GPRC5A,对胃癌细胞的多种生物学行为产生影响,能够对胃癌发生发展机制的研究提供新的启迪。