产Monacolin K红曲霉的诱变选育及发酵条件的研究

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红曲霉是一种药食两用菌,在我国已有千余年的使用历史。红曲霉的发酵产物之一,Monacolin K具有抑制体内胆固醇合成的作用,对降低血糖、调节血脂等都具有明显的功效,具有广阔的市场前景和实用价值,已被广泛应用与食品、保健、医药、饲养等多个领域。本论文研究了发酵液中Monacolin K的双波长检测法,并将该检测方法应用于发酵液中Monacolin K的提取,获得一种简单高效的MonacolinK超声提取新方法,并对该提取工艺进行优化;以实验室保藏的红曲霉ZL307为出发菌株,使用诱变选育的育种方法筛选出一株产Monacolin K较高的红曲菌株ZY307-2;然后对该诱变菌株进行发酵培养研究其发酵条件,并通过响应面法优化得到其最佳发酵条件;最后对发酵液中某些无机盐和有机溶剂对Monacolin K产量的影响进行了研究,确定了在发酵液中适量添加一些添加剂可以有效的提高Monacolin K的产量。研究以超声辅助的方法对发酵液中Monacolin K进行提取的效果,通过对各种常见的提取剂对Monacolin K的提取效果的研究,确定乙醇为最佳提取剂;然后通过单因素实验确定各提取条件的最佳范围,以正交实验对各条件进行优化,得出结论。超声提取发酵液中Monacolin K的最佳提取条件为:提取温度60℃,超声功率250W,乙醇浓度75%,时间40min,料水比1:8。该提取工艺较传统工艺在提取时间和操作步骤方面有较大提升。选择紫外-亚硝酸钠复合诱变法对原始菌株红曲霉ZL307进行诱变,以紫外诱变30s后再以0.05mol/L浓度的亚硝酸诱变90s,通过Lovastatin抗性平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法,得到一株MonacolinK产量较高的红曲菌突变株ZY307-2,经实验验证,该菌株遗传稳定性良好,Monacolin K产量有较大提高,较诱变前提高了50.6%。对诱变得到的ZY307-2红曲菌株进行摇瓶发酵,研究以天然农作物作为培养基质发酵产Monacolin K的情况,得出以玉米粉和豆渣为混合培养基对该菌株进行发酵Monacolin K产率较好。然后通过Plackett-Burman设计法筛选出对Monacolin K产率影响较显著的三个因素;通过Box-Behnken实验对三个显著因素进行响应面分析,得出结论,红曲菌ZY307-2发酵产Monacolin K最佳条件为:玉米粉8g,豆渣添加量2.1g,初始pH5.13,培养温度28.4℃,装液量70mL,接种量5%,摇床转速150r/min。在此条件下,红曲霉液态发酵MonacolinK的产率达到219.6μg/mL,比未经优化前提高了49.1%。最后对比较常见的用作发酵添加剂的四种无机盐MgSO4、 ZnSO4、CaCl2、KH2PO4和毒性较低的四种有机溶剂乙酸乙酯、乙醇、乙酸、柠檬酸,作为添加剂对Monacolin K产率的影响进行实验研究,研究发现:浓度为0.6g/L的MgSO4、浓度为1.5g/L的KH2PO4和分次添加总量为1.5mL的乙酸,可以有效促进ZY307-2红曲菌株产Monacolin K的能力,提高发酵产量。
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