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目的： 随着经济发展、饮食习惯和生活方式的改变，肥胖发病率逐年攀升，肥胖问题日趋严重。肥胖可影响血液中糖类和脂类的水平，进而引发高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪性肝病等多种代谢性疾病。肥胖已成为世界范围内最为严重的健康问题之一，造成巨大的医疗和经济负担。 肥胖发生的主要原因是过量的能量摄入和运动缺乏，但它们无法完全解释当前肥胖发病率上升如此之快的原因。一系列研究表明，内分泌干扰物(Endocrine DisruPting Chemicals，EDCs)的暴露与肥胖密切相关。加利福尼亚大学的Blumberg教授将这类物质命名为肥胖激素(Obesogens)，有机锡是其中最具代表性的一类。我们和其他研究小组的研究都已证明青春前期暴露于低剂量的三丁基锡(Tributyltin，TBT)可以导致小鼠成年期肥胖。肥胖是Ⅱ型糖尿病的病因之一。TBT诱导的肥胖是否影响胰岛素的敏感性从而诱发胰岛素抵抗，罕有文章报道。胰岛素作用的经典通路是PI3K-Akt信号通路。在机体摄食后，胰岛分泌的胰岛素通过血液作用于细胞膜表面的胰岛素受体。激活的胰岛素受体进而活化胞内磷脂酰肌醇激酶（PhosPhoinositide3-kinase，PI3K），进而催化激活蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt);激活后的Akt可通过调节一系列下游分子，包括糖原合成酶激酶-3等(Glycogen synthase kinase3，GSK3)来增加糖原的生成，同时使磷酸化叉头框蛋白O1（Forkhead box Protein O1，FoxO1）出核失活，从而达到抑制糖异生基因的表达，降低了机体血糖。PI3K-Akt信号通路在细胞的代谢过程中起极其重要的作用并受多种因素调节。因此，研究TBT对PI3K-Akt信号通路的影响可以更好的揭示TBT对哺乳动物产生肥胖及相关疾病的机制。 本课题将基于以下几方面来探析TBT诱导肥胖的效应机制和分子基础;1）暴露于环境水平的TBT后引起相应的表型改变:体重、体脂率、血脂指标等;2）TBT暴露诱发的肥胖是否伴随着糖代谢紊乱;3）采用油红O染色和免疫组化检测TBT暴露对肝脏及肝脏中AKT活性的影响;4）免疫印迹实验进一步验证TBT对肝脏、肌肉组织中PI3K-Akt通路的影响;5）采用定量PCR扩增技术检测TBT对脂肪分化相关因子和Akt2基因表达的影响;6）通过流式细胞技术分析TBT暴露对脂肪干细胞分化的影响; 方法： 1.TBT染毒实验 21日龄雄性SPF级ICR小鼠适应性喂养7天后根据体重随机分成为3组，每组10只。小鼠每3天进行一次腹腔注射，周期30天。注射物为溶剂对照（玉米油）、溶于玉米油的TBTC1，其染毒剂量为5、50μg/kg（按照5ml/kg·bw注射）。每次腹腔注射前称量并记录体重，根据当天的体重调整注射量。最后一次TBTC1染毒后，对小鼠再进行30天的正常饲养。 2.口服葡萄糖耐量试验检测 为了检验TBT暴露是否影响小鼠的葡萄糖代谢，我们测定了小鼠的空腹血糖并进行了口服葡萄糖耐量试验。实验结束前3天，各组小鼠禁食过夜后，测定了小鼠的血糖浓度，即为小鼠的空腹血糖浓度。之后，每只小鼠经口灌胃葡萄糖溶液(2g/kg·bw)，并于灌胃后15分钟，30分钟，60分钟和120分钟尾静脉血液采样测量小鼠的血糖水平。 3.TBT暴露组小鼠肥胖表型的检测 实验终点时，每个剂量组随机抽取7只小鼠，称量体重，轻微麻醉后从小鼠眼眶后静脉丛采血，室温下静置2h后，3000g*15分钟分离血清并储存于-80℃以检测血清中甘油三酯（TG，Triglyceride）、总胆固醇(TC，total cholesterol)、瘦素、脂联素及高密度脂蛋白(HDL，high density lipoprotein)和低密度脂蛋白(LDL，low density lipoprotein);小鼠取血后颈椎脱臼法处理，解剖、分离附睾脂肪组织和肾周脂肪组织，称重后液氮速冻，保存于-80℃冰箱;分离小鼠肝脏并储存于4％多聚甲醛溶液中。将每组剩余的小鼠腹腔注射1U/kg体重的胰岛素，8分钟后处死小鼠，迅速分离肝脏、大腿骨骼肌肌肉组织，将一部分肝脏置于4％多聚甲醛溶液中，剩余的肝脏和肌肉组织在液氮中速冻后-80℃保存。 4.油红O染色 肝脏组织固定24h后，采用不同浓度的蔗糖溶液梯度脱水，OCT包埋后冷冻切片，做油红O染色，观察TBT暴露是否会引起小鼠肝脏脂肪堆积。 5.免疫组化法检测 免疫组化方法检测注射胰岛素后小鼠肝脏中Akt及其磷酸化蛋白的表达，探讨TBT暴露对肝脏中Akt的活性影响。 6.Western blotting检测 Western blotting检测肝脏、骨骼肌中Akt及其磷酸化型蛋白表达情况，探讨TBT暴露对PI3K-Akt通路的影响。 7.流式细胞技术检测TBT对附睾脂肪组织中干细胞的影响 21日龄的雄性SPF级ICR小鼠10只，适应性喂养7天后分为两组（玉米油和50μg/kg TBTC1组），小鼠每3天进行一次腹腔注射，周期30天。最后一次TBTC1染毒处理后，小鼠继续饲养20天后，连续3天注射Brdu50mg/kg。再过1周后处死小鼠，取其附睾脂肪组织，胶原酶消化后，用DMEM培养基（内含10％小牛血清）冲洗，离心(269g，10min)重悬，200目筛网除去组织块，离心沉淀收取脂肪干细胞;对分离的脂肪干细胞加入抗-Brdu、CD29、Sca-1等抗体检测TBT对脂肪组织中干细胞分化的影响。 8.定量RT-PCR分析 使用Trizol提取脂肪组织总RNA，并使用定量RT-PCR分析脂肪生成主要调节转录因子PPARγ、C/EBPs和各种标志基因的表达情况。以GAPDH为内参，检查各靶基因融解曲线并分析各目的基因的相对表达情况。研究TBT暴露对脂肪组织中脂肪生成主要调节转录因子表达的影响。 结果： 1.TBT暴露增加了小鼠体重和附睾脂肪组织的质量 实验期间，对照组和各TBT暴露组小鼠活动及精神状况正常，各组之间小鼠毛色油光发亮，无戗毛情况。体重测试结果显示，相对于对照组，50μg/kg TBTC1组小鼠从暴露15天后直至实验终点小鼠体重显著增加（P＜0.05）。解剖结果显示50μg/kg TBTC1组小鼠附睾脂肪组织质量也显著增加（P＜0.01）。 2.TBT暴露降低了小鼠的葡萄糖耐受性 空腹血糖测试结果显示，与对照组相比，暴露于TBT组小鼠的空腹血糖指标没有显著性变化。口服葡萄糖耐量试验结果显示，在60、120分钟时，50μg/kgTBTC1组小鼠血糖浓度显著高于对照组(P＜0.05,P＜0.01)。这表明TBT暴露会降低小鼠的葡萄糖利用率并导致血糖耐量异常。 3.TBT对小鼠血脂水平的影响 血脂水平分析结果显示TBT处理导致小鼠血脂水平呈剂量依赖性增长，相对于对照组，50μg/kg TBTC1组小鼠的TC升高了23％(P＜0.01)、TG升高了28％(P＜0.05）、HDL升高了24％(P＜0.01)，LDL升高了107％(P＜0.001)。TBT处理导致TBT暴露组小鼠内脏器官周围的脂肪质量显著增加并伴随高脂血症，所以我们进一步检测了脂肪组织分泌的脂联素和瘦素，结果显示5和50μg/kg TBTC1组中的脂联素的浓度均显著低于对照组(P＜0.01;P＜0.001)，但TBT暴露组小鼠血清瘦素水平与对照组相比无显著性差异。 4.TBT暴露诱发非酒精性脂肪肝 小鼠肝脏油红O染色结果显示，与对照组相比，TBT暴露组的肝脏内脂滴含量增加并呈剂量依赖性。低剂量组中，小鼠肝脏内有少量区域检测到脂滴聚集，而高剂量组小鼠肝脏内有较多的脂滴充盈于肝细胞内，实验结果表明TBT暴露可导致小鼠肝脏脂肪代谢紊乱并诱发非酒精性脂肪肝。 5.TBT暴露降低了小鼠Akt的活性 葡萄糖耐量实验和肝脏油红O染色显示TBT处理可影响小鼠对胰岛素的敏感性。为了检测TBT暴露组小鼠对胰岛素的反应能力的影响，我们用免疫组化法检测注射胰岛素后小鼠肝脏中的Akt、P-Akt蛋白表达情况。与对照组相比，暴露于TBT组小鼠的P-Akt/Akt比值显著降低(P＜0.001)。为进一步验证TBT暴露对PI3K-Akt通路的影响。我们检测注射胰岛素后小鼠肝脏和骨骼肌组织中的Akt、P-Akt(Ser473)以及P-Akt(T308)蛋白表达情况，检测结果显示TBT暴露未对总Akt表达未发生显著性的改变，但P-Akt(Ser473)以及P-Akt(T308)的表达显著降低。提示TBT暴露会降低小鼠Akt的活性。 6.TBT暴露对BrdU标记的脂肪干细胞的影响 为进一步探索TBT暴露对脂肪干细胞的影响，我们采用BrdU标记法检测对照组与50μg/kg TBTC1组小鼠脂肪干细胞的分化情况。相对于对照组，TBT暴露组的CD29+CD34-群、CD29+Sca-1+群、CD29+BrdU-群显著降低，而其他群组无明显差异。 7.TBT暴露影响脂肪组织中脂肪生成主要调节转录因子的表达 定量PCR结果显示，与对照组相比，50μg/kg TBTC1组Pref-1、Akt2相关基因表达量显著降低(P＜0.01;P＜0.05)。这表明TBT暴露会影响脂肪组织中脂肪生成主要调节转录因子的表达。 结论： 1.青春期暴露于环境水平的TBT会诱发肥胖及代谢综合征。 2.环境水平TBT的暴露可能会影响脂肪干细胞的分化。