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电压门控钾离子通道为同源四聚体蛋白,每个亚基由一个电压感受结构域(S1-S4)和一个孔结构域(S5-S6)构成,其中电压感受结构域(VSD)起着感受膜电位并控制通道开关的作用。新近发现的人源电压门控质子通道(Hv1)的编码基因与电压门控钾离子通道电压感受结构域(VSD)同源类似,但不含有钾离子通道的孔结构域。电压门控质子通道Hv1对质子具有特异高选择性,能够高效地跨膜转运质子。依据该通道各氨基酸残基的疏水特性,可将Hv1蛋白全长划分为3个结构域:N-端胞外结构域、跨膜结构域和C-端胞外结构域。
本论文中,以Hela细胞作为工具细胞,表达全长Hv1及其变异体蛋白,并利用Tim23多克隆抗体作为探针标记细胞线粒体。研究发现Hv1表达在Hela细胞的线粒体上,并且其C-端胞外结构域对Hv1的亚细胞定位具有重要的作用。
为进一步研究Hv1的C-端胞外结构域(C—Hv1)对该通道的影响,以大肠杆菌BL21(DE3)作为重组蛋白表达用的受体菌,获得了大量可溶性目的蛋白。通过亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析技术对目的蛋白进行纯化,得到了高纯度的C-Hv1。利用圆二色光谱、尺寸排阻色谱和超离心沉降平衡分析等技术研究了C-Hv1在不同pH值条件下的结构特性。实验结果表明该蛋白在不同pH值条件下均含有α螺旋二级结构,并形成二聚体。
运用气相扩散悬滴法结晶出了C-Hv1高分辨率晶体,收集了2.0(A)分辨率的衍射数据,解析出了该蛋白的三维空间结构。解析结果表明该蛋白为平行的α超螺旋结构,为进一步研究Hv1的结构和功能奠定了重要的物质基础。