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◎背景和目的:活性维生素D(1 α,25(OH)2D3),是目前临床上干预骨质疏松及其并发症骨折的基础药物,其不仅能大大降低绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症的骨折发病率,对类固醇性骨质疏松症也有着重要的临床治疗价值。最近几年时间里,有多种活性维生素D类似物基于原有药效进一步优化了药学性能,从而能够为骨质疏松症的治疗带来了新的希望。其中,具有较好代表性的艾地骨化醇(Eldecalcitol,ELD),在血液中半衰期明显延长,生物利用度大大提高,同时因其能够减少对甲状旁腺激素的抑制从而弥补了原有活性维生素D引起钙、磷失衡的缺陷,优化了对骨质代谢的调节。2011年在日本被应用于临床治疗骨质疏松症以来获得了较好的临床疗效评价(国内目前仍处于临床前期研究论证阶段)。尽管如此,为了更好地理解和应用ELD改善骨质疏松的药理效果,相关机制仍有待进一步深入探讨。作为骨重建当中的重要功能细胞,破骨细胞与成骨细胞两者间存在着密切的相互偶联作用关系。课题组在前期工作中还明确了破骨细胞和前成骨细胞之间也存在着相互影响的形态学位置关系,并论证了骨代谢过程中破骨细胞的存在与否,直接影响到前成骨细胞的增殖分化和生物活性。本课题拟在前期工作基础上,通过相关的实验设计,探究破骨细胞骨吸收上清在艾地骨化醇改善骨质疏松促进新骨形成过程中的作用及其相关机制。预期成果将为骨质疏松症治疗药剂的开发提供更深层次的靶点和思路,具有积极的科学意义。◎材料和方法:1.课题第一部分体内实验,通过卵巢摘除(ovariectomy,OVX)手术与肿瘤化疗药物环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)投给,模拟构建老年妇女绝经后雌激素缺乏和肿瘤化疗药物应用所导致的骨质疏松动物(大鼠)模型后,按照25 ng/kg/天的投药标准经口投给艾地骨化醇2周或4周,获取大鼠胫骨作为组织形态学评价对象。通过对石蜡切片进行苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色对比观察骨组织形态变化;通过ELISA检测骨代谢的血清标志物;应用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测破骨细胞存在状态;利用免疫组织化学染色方法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、组织蛋白酶 K(Cathepsin K,CK)、基质金属蛋白酶 9(Matrixmetalloprotein 9,MMP9)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的表达情况,综合评价雌激素缺乏和环磷酰胺应用所导致的骨组织病理学改变及投给ELD后骨组织的形态变化,从而探究评价ELD对原发性骨质疏松(雌激素缺失导致)及继发性骨质疏松(药物应用引起)的治疗效果。2.课题第二部分体外实验,诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化为功能性破骨细胞,获取分化的破骨细胞培养上清液(osteoclast culture supernatant OCS);同时将分化的破骨细胞与牛骨片共培养,获取破骨细胞骨吸收培养上清液(bone resorption culture supernatant,BRS)。随后,使用 OCS 和 BRS 两种培养上清液与ELD组合处理小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1。通过细胞计数试剂盒-8(CCK8)评估MC3T3-E1细胞增殖活力,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测MC3T3-E1细胞成骨活性,利用逆转录定量(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western-blot)分析评估成骨相关蛋白的表达情况。综合评价破骨细胞及破骨细胞骨吸收过程在ELD改善骨质疏松及促新骨形成过程中所扮演的角色。3.课题的第三部分通过生物信息学预测和相关文献综合分析,推测BMP-2、TGF-β以及柠檬酸钠(TCD)可能在ELD促新骨形成过程中发挥重要作用,通过相关体外实验进行验证。体外培养的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在成骨诱导培养基中诱导分化7天,分别在有/无BMP-2、TGF-β1、柠檬酸盐刺激下,通过CCK8、ALP活性检测、RT-PCR、Western-blot方法,检测成骨细胞的增殖活性、早期分化程度及胞内相关信号通路关键蛋白的表达水平,对BMP-2、TGF-β1、柠檬酸盐单独以及与ELD协同影响成骨细胞增殖和分化的作用进行分析评价。其中,BMP-2组通过Western-blot方法,检测成骨细胞分化标志蛋白Runx2及smad1/5/9、p38、JNK相关信号通路的表达。TGF-β 1 组通过 RT-PCR 检验 Runx2、OCN、OPN 以及 Collagen Ⅰ 的表达,Western-blot检测成骨细胞内smad3、Akt、p38、JNK信号通路相关蛋白的表达水平。柠檬酸盐组通过Western-blot方法,检测成骨细胞分化标志蛋白Runx2、OCN的表达水平,通过柠檬酸盐特异性抑制剂分析柠檬酸盐对于成骨分化的必要性,通过mTOR阻断剂雷帕霉素(Rapamycin)明确柠檬酸钠是否通过mTOR信号通路影响成骨细胞分化功能。◎结果:1.8周龄雌性大鼠卵巢摘除(OVX)手术4周后,胫骨组织切片HE染色结果显示骨小梁数量明显减少,提示雌激素缺乏导致的骨质疏松症动物模型制备成功。与对照组相比,OVX组胫骨近端干骺端部表现为小梁骨骨量减少,骨基质表面成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性升高,破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)表达与组织蛋白酶K(CK)表达增强,提示该区域的骨转换率较对照组升高。艾地骨化醇(ELD)投给后骨转换率明显下降,具体表现为成骨细胞的ALP表达降低以及破骨细胞TRAP阳性表达区域减少和组织蛋白酶K的免疫活性下降,干骺端部的小梁骨骨量增加。环磷酰胺(CTX)投药2周后,胫骨干骺端部骨小梁数量减少、分离度增加,提示骨质疏松建模成功。ELD用药能够纠正CTX所诱导的骨质疏松现象,表现为骨量增加,骨转换率由CTX诱导的高转换率下降至与正常对照组相似。2.ELD的投给降低了 MC3T3-E1细胞存活率,在影响成骨细胞分化方面表现出了先抑制后促进的特点。破骨细胞培养上清液(OCS)能够改变ELD对前成骨细胞增殖的抑制作用,但在ELD影响前成骨细胞分化方面没有体现出较为明显的调控功能。破骨细胞骨吸收培养上清液(BRS)改善ELD抑制前成骨细胞增殖的效果不明显,但能够明显提高ELD促进前成骨细胞分化的程度。3.BMP-2、TGF-β1、柠檬酸钠(TCD)分别呈剂量、时间依赖性提高前成骨细胞存活率,促进成骨分化,且与ELD合用的促进作用更强。Western-blot结果显示,BMP-2、TGF-β1、柠檬酸盐均能促进成骨分化标志物Runx2表达,BMP-2显著上调smad1/5/9、p-JNK表达量,TGF-β1显著上调smad3、p-Akt、p-p38、p-JNK的表达,柠檬酸钠上调mTOR的表达,和ELD协同作用效果更强。◎结论:1.艾地骨化醇能够改善雌激素缺乏诱导的原发性骨质疏松以及肿瘤化疗药物环磷酰胺应用所导致的继发性骨质疏松。2.ELD在体外抑制成骨细胞增殖和早期分化,但破骨细胞分泌介质和/或破骨细胞骨吸收释放相关因子可以改变ELD对成骨细胞的调控作用,特别是骨吸收释放因子能够显著加强ELD促进成骨分化效果。3.BMP-2 通过 smad1/5/9、JNK 相关信号通路,TGF-β 1 通过 smad3、Akt、p38、JNK信号通路,柠檬酸盐通过mTOR信号通路影响ELD促进成骨分化。