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背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是由突然的外力作用导致的急性神经损伤性疾病,是世界范围内致死致残的主要病因之一。目前,尚没有治疗措施能够在TBI后有效的修复神经损伤和改善神经功能恢复。新近的研究发现存在于成体哺乳动物中枢神经再生区域之一的海马齿状回(dentate gyrus,DG)颗粒层下区的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在TBI后神经损伤修复和神经功能重建过程中发挥积极作用,从而使得海马区神经再生逐渐成为一个研究焦点。致力于TBI后海马神经再生的研究者们都在不遗余力的探索能够促进NSCs增殖和向神经元分化的新策略。TBI后海马区NSCs的增殖分化能力受到许多病理因素的影响,其再生修复潜能比较低下,不足以修复受损的神经。其中,TBI后海马区的神经炎症是制约NSCs发挥修复损伤能力的重要因素之一。神经炎症在TBI的病理生理机制中发挥重要作用,其在某种程度上对于损伤脑组织具有一定的保护作用,但通常情况下神经炎症会过度反应并降低海马区NSCs的再生修复能力和导致更差的神经功能恢复。小胶质细胞(microglia,MG)在激活和调节神经炎症反应的过程中发挥关键作用。目前的研究发现MG对海马区神经再生具有“双刃剑”作用。活化的MG有M1型和M2型两种极化状态,M1型是促炎类型,M2型是抑炎类型。MG向M1型极化不利于海马区NSCs发挥再生修复功能,而MG向M2型极化则能够促进海马区NSCs增殖分化。因此,探索能够在TBI后促进海马区MG由M1型向M2型转化的新策略对于抑制过度的神经炎症反应并提升NSCs再生修复能力和改善神经功能恢复具有重要意义。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是脑组织富含并对MG极化状态具有重要调控作用的生物活性分子。其中,miR-124是脑组织特异性表达并在MG中呈高表达的miRNA。在生理情况下,miR-124可以调控MG的生物学功能并维持其处于静息状态。在病理情况下,下调miR-124的表达可以促进MG由M2型向M1型极化并增加神经炎症;而上调miR-124的表达可以促进MG由M1型向M2型极化并减轻神经炎症。鉴于此,在TBI后将miR-124输送至中枢神经系统以提高海马区miR-124的含量可能是一种促进MG由M1型向M2型转化并进而提升NSCs再生修复能力的有力策略。然而,裸露miR-124的生化性质极不稳定而脆弱,很容易被降解而失去作用。因此,寻求能够将miR-124完整递送至中枢神经系统并发挥其生物学作用的可行方法具有重要的基础研究和实际应用价值。最新研究提示外泌体也许有希望成为一种可以将miR-124输送至中枢神经系统并使其发挥功能的重要载体。外泌体是由细胞分泌的直径为30-100nm的微粒,它具有磷脂包膜并富含蛋白质、磷脂、mRNAs和miRNAs等生物活性分子。外泌体的诸多优点使得其具有递送miR-124至中枢神经系统的潜能。首先,外泌体能够自由通过血脑屏障,这使得输送miR-124至中枢神经系统成为可能;其次,外泌体的磷脂包膜可以保护其内含物在输送过程中不被分解破坏,这使得miR-124在被输送至大脑后仍然能够保持结构完整和具有生物学功能。已有研究发现富含miR-124的外泌体可以促进N9型MG由M1型向M2型极化。然而,外泌体源性miR-124(exosome miR-124,Exo-miR-124)是否能够调控TBI后海马区MG的极化状态并进而影响神经再生,以及潜在的作用机制是什么尚不清楚。基于其他研究者的发现,Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)信号通路可能与Exo-miR-124调控TBI后海马区MG极化状态的作用机制相关。首先,TLR4特异性激活分子磷酸脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以活化海马区MG并抑制神经再生。其次,LPS可以增加TLR4信号通路下游分子NF-κB的表达水平,并最终诱导了不利于神经再生的炎症因子IL-6和TNF-α的释放。此外,新近的研究发现抑制TLR4的表达可以诱导MG向M2型极化并减轻了神经炎症,且过表达miR-124可以通过作用于TLR4的方式抑制LPS引起的MG活化。因此,TLR4通路可能在Exo-miR-124调控TBI后海马区MG极化状态并影响神经再生的机制中发挥重要作用。目的本研究的目的是探索利用Exo-miR-124调控TBI后海马区MG的极化状态并进而影响神经炎症、神经再生的可能性;并探讨Exo-miR-124是否是通过作用于TLR4信号通路调控了MG的极化状态。本研究结果将有望为探索利用外泌体将miR-124输送至大脑并改善TBI后神经功能恢复的新策略提供理论参考。方法1.利用装载miR-124的质粒或空载质粒(Control)转染大鼠骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs),通过实时定量聚合酶链法(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)鉴定转染效果。然后应用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒从转染了miR-124或miR-Con的MSCs培养液上清中提取外泌体,通过电镜观察和蛋白印迹法(Western Blotting,WB)鉴定提取的外泌体,并应用qRT-PCR检测Exo-miR-124和Exo-Con这两种外泌体中miR-124的含量。2.将168只大鼠随机分为假损伤组(Sham)、TBI组、TBI+Exo-Con组和TBI+Exo-miR-124组,每组42只。利用控制性皮层损伤方法构建TBI大鼠模型,通过尾静脉在TBI构建后24小时将Exo-Con或Exo-miR-124注射入大鼠体内。在TBI后第3/7/14/28天,利用qRT-PCR检测miR-124的表达量;利用反转录聚合酶链法(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和M2型MG特征性分子CD206、Arginase-1的表达水平;并利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)以检测促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平。3.为了分析Exo-miR-124对TBI后海马MG的调控机制以及TLR4信号通路在其中的作用,首先利用RT-PCR检测TBI后第3/7/14/28天海马组织内TLR4信号通路分子TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF6和NF-κB的表达水平。然后在体外将BV2型MG分为BV2(空白对照)组、BV2+LPS组、BV2+LPS+Exo-Con组和BV2+LPS+Exo-miR-124组。利用qRT-PCR检测BV2细胞内miR-124的表达水平;利用WB检测前述TLR4信号通路分子的表达水平;利用RT-PCR检测M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206的表达水平;利用ELISA检测促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平。4.为了探讨Exo-miR-124调控TBI大鼠海马区MG极化状态后对NSCs增殖分化能力的作用。首先,利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测TBI后第7天海马区新生NSCs即BrdU~+/SOX2~+细胞和TBI后第28天由NSCs分化的神经元即BrdU~+/NeuN~+细胞数量。然后,利用神经功能评分(Neurological severity score,NSS)方法在TBI后7/14/21/28天评估运动、感觉等神经功能恢复情况;利用Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)在TBI后24-28天评估认知记忆恢复情况。结果1.成功构建了高表达miR-124的外泌体即Exo-miR-124和Exo-Con,电镜图像显示外泌体为30-100nm的膜性微粒,WB提示CD9、CD63和CD81呈高表达,qRT-PCR提示Exo-miR-124中miR-124的表达水平明显高于Exo-Con。2.TBI后海马组织内M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206的表达水平升高;且促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平也升高。与Exo-Con相比,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内后,海马组织内miR-124的表达量升高;M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平升高,而M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平降低。3.TBI后海马组织内TLR4信号通路分子TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF6和NF-κB的表达水平升高。与Exo-Con相比,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内降低了TLR4信号通路分子的表达水平。利用LPS刺激BV2细胞后,TLR4信号通路分子的表达水平升高。与Exo-Con相比,Exo-miR-124处理提高了BV2细胞中miR-124的表达水平并降低了TLR4信号通路分子的表达水平。LPS刺激BV2细胞后M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平升高。与Exo-Con相比,Exo-miR-124处理降低了前述M1型MG特征性分子和促炎因子的表达水平,并提高了M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平。4.TBI后海马区新生NSCs即BrdU~+/SOX2~+细胞和NSCs分化为神经元即BrdU~+/NeuN~+细胞的数量均增多。与Exo-Con相比,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内后,新生NSCs和NSCs分化为神经元的数量进一步升高。NSS和MWM评分提示TBI后大鼠的神经功能、认知记忆能力均受损;与Exo-Con相比,Exo-miR-124促进了神经功能和认知记忆能力的恢复。结论TBI后大鼠海马区M1型和M2型MG均活化,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内促进了MG由M1型向M2型极化;且体内外实验均提示Exo-miR-124是通过抑制TLR4信号通路的活性促进了MG由M1型向M2型极化。进一步研究发现,Exo-miR-124促进TBI大鼠海马区MG由M1型向M2型极化后提高了NSCs的增殖分化能力和改善了神经功能恢复。