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在过去的三十年中,糖尿病在全世界范围内已成为一种新型“流行病”,目前我国的糖尿病患者已超过1亿,居全球第一位。对于糖尿病患者而言,任何创面均有可能发展形成严重感染的慢性创面,甚至造成截肢,严重影响愈合及患者生存质量。在控制血糖的前提下,对于创面彻底清创、避免感染,促进创面愈合是糖尿病创面主要的治疗方式。但是传统方法存在治疗时间长、次数多、复发率高的问题,临床对于新型有效的治疗方法需求极大。羊膜位于胎盘最内层,厚度约为8-12um,不含神经及血管。研究表明羊膜具有促进细胞迁移及扩增、免疫源性低、减轻炎症、含有大量的生长因子和细胞因子等特点。自1910年羊膜首次作为敷料用以创面治疗以来,随着保存技术的发展,使羊膜在眼科疾病、烧伤救治、整形修复、口腔疾病及神经外科等领域都有广泛的应用。羊膜上皮层是由单层立方上皮细胞构成,称之为羊膜上皮细胞。多项研究表明,人羊膜上皮细胞表达多种干细胞标志物,并具有向三个胚层分化的能力,而且能够分泌多种生长因子。同时因其来源广泛和便于分离,无免疫源性和致瘤性,使羊膜上皮细胞成为移植和再生医学潜在的细胞来源。羊膜上皮细胞在组织修复中的应用已有诸多报道,目前羊膜上皮细胞已在肝、神经、肺、心肌甚至肿瘤治疗中都有一定的优势,但是尚少有羊膜上皮细胞应用于糖尿病创面的研究。因此在本课题中,我们通过提取培养羊膜上皮细胞,应用于糖尿病创面中以观察其对于创面愈合的作用并对其机制进行初步探索。第一部分人羊膜上皮细胞体外分离培养鉴定及生物学特性检测目的:分离培养人原代羊膜上皮细胞并检测鉴定。方法:收集剖宫产胎盘分离羊膜,通过酶消化法提取羊膜上皮细胞体外培养。流式细胞计数检测羊膜上皮细胞表型,免疫荧光法及RT-PCR法检测羊膜上皮细胞干性标志物,最后对其进行三胚层诱导检测其分化潜能。结果:体外人羊膜上皮细胞镜下观察可见细胞成鹅卵石样成团生长,核圆,居中,细胞呈多边形,边界清楚,轮廓分明。通过流式细胞仪检测显示培养细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,但是不表达CD45、CD34。通过免疫荧光检测发现,羊膜上皮细胞表达SSEA-3、SSEA-4、OCT4。RT-PCR结果显示羊膜上皮细胞表达OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。诱导分化实验证明羊膜上皮细胞具有向三胚层分化潜能。结论:采用酶消化法成功分离培养羊膜上皮细胞,其可以表达多种干细胞标志物,并能够向三胚层分化,在组织修复中具有很大的潜力。第二部分羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合作用的研究目的:研究羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合的作用。方法:将原代提取的羊膜上皮细胞局部注射糖尿病创面,观察创面愈合情况。收集创面标本行病理学以观察创面愈合情况;行CD31免疫组化检测创面血管化;行CD68、iNOS、CD206免疫荧光检测巨噬细胞极化;行促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和促进愈合因子(VEGF、TGF-β1、IGF-1)的ELISA检测炎症反应的改变。通过标记羊膜上皮细胞,观察羊膜上皮细胞在创面的转归情况。结果:(1)与空白组相比,羊膜上皮细胞组在创面第10、14天创面愈合率明显升高(P<0.01)。(2)通过病理检测显示创面第10天羊膜上皮细胞组新生肉芽组织厚度较PBS组明显增加(P<0.01);CD31免疫组化显示创面羊膜上皮细胞组创面新生毛细血管密度较PBS组明显增多(P<0.01);羊膜上皮细胞组创面M1型巨噬细胞密度明显低于PBS组(P<0.01),M2型巨噬细胞密度明显增对高(P<0.05),M1/M2比例也明显降低(P<0.01);羊膜上皮细胞组创面组织中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表达量明显高于PBS组的表达量(P<0.01),而IL-1β、IL-6、TNF-α表达量明显较空白组低(P<0.01)。(3)羊膜上皮细胞植入创面第5天,可观察到创面有大量羊膜上皮细胞存活;在创面第10天,可观察到创面少量羊膜上皮细胞存活。结论:羊膜上皮细胞通过调控巨噬细胞极化、减轻创面炎症反应、促进创面血管新生以促进糖尿病创面愈合;同时其在创面存留时间较短,旁分泌作用可能在促进糖尿病创面愈合过程中起主要作用。第三部分羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合机制的初步探讨目的:探索羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合作用的机制方法:(1)体外分离培养巨噬细胞,通过IFN-γ、TNF-α刺激模拟创面M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化情况,观察羊膜上皮细胞条件培养基对于巨噬细胞极化的作用,同时收集细胞行RT-PCR检测其基因表达,实验分组为:含10%胎牛血清的DMEM培养基+IFN-γTNF-α阳性对照组,含10%胎牛血清的DMEM培养基+羊膜上皮细胞条件培养基+IFN-γTNF-α组,含10%胎牛血清的DMEM培养基空白对照组。(2)体外培养人脐静脉内皮细胞,通过CCK-8试剂盒、Transwell小室以及成管试验来观察羊膜上皮细胞条件培养对于人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响,实验设计分为3组:含10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组,羊膜上皮细胞条件培养基组,高糖DMEM阴性对照组。结果:(1)应用羊膜上皮细胞条件培养基对于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬细胞可以减少细胞周围的细短树突状突起;羊膜上皮细胞条件培养基处理组巨噬细胞CD206(M2型巨噬细胞标志物)的表达量较空白对照组(P<0.01)和阳性对照组明显升高(P<0.01);而iNOS(M1型巨噬细胞标志物)的表达量较空白组(P<0.05)和阳性对照组明显降低(P<0.01)。(2)CCK-8试剂盒检测人脐静脉内皮细胞的增殖活性显示,应用羊膜上皮细胞条件培养基处理组较阴性对照组能够明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖(P<0.01);Transwell小室检测迁移能力结果表明羊膜上皮细胞条件培养基处理组细胞个数较阴性对照组明显增多(P<0.01);通过成管实验检测细胞成管能力,结果显示羊膜上皮细胞条件培养基处理组成管个数较阴性对照组明显增多(P<0.01)。结论:羊膜上皮细胞可以明显提高人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力,还可以逆转巨噬细胞向M1型转化,同时可以促进M1型巨噬细胞向M2型细胞转化,并以此促进糖尿病创面的愈合。