【摘 要】
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棉花细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)系已应用于棉花杂交育种的生产实践,但棉花CMS机理尚不清楚。之前研究发现,哈克尼西棉CMS系线粒体基因组中存在一个特有的开放阅读框(ORF):orf160,该ORF在棉花CMS系中是转录的,但在棉花正常可育系中未检测到该ORF的表达,推测orf160可能与棉花CMS相关。但该ORF在蛋白水平表达情况如何尚不清楚,且缺
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棉花细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility,CMS）系已应用于棉花杂交育种的生产实践,但棉花CMS机理尚不清楚。之前研究发现,哈克尼西棉CMS系线粒体基因组中存在一个特有的开放阅读框（ORF）:orf160,该ORF在棉花CMS系中是转录的,但在棉花正常可育系中未检测到该ORF的表达,推测orf160可能与棉花CMS相关。但该ORF在蛋白水平表达情况如何尚不清楚,且缺乏相应的研究用抗体,所以有必要制备出ORF160蛋白的抗体,为后续进一步探究orf160在蛋白表达水平的差异、明确orf160与棉花CMS的相关性奠定基础。本文对orf160基因进行原核表达密码子优化,合成并分析,PCR扩增并引入Rsr II和Not I限制性酶切位点,双酶切法构建重组表达载体;利用E.Coli BL21（DE3）原核表达目的蛋白ORF160,确定表达形式,优化表达条件,Ni2+柱纯化,抗His-tag抗体的Western Blot检测;以ORF160为抗原腹腔免疫Balb/C鼠制备鼠单抗,测定效价,鉴定抗体特异性,初步建立检测ORF160的双抗体夹心法。结果表明目的基因orf160共480 bp,编码159个氨基酸,将orf160双酶切后连接表达载体pET-B2M,经鉴定成功构建重组表达载体orf160-pET-B2M。目的蛋白ORF160在E.Coli BL21（DE3）中表达为包涵体蛋白,符合预期蛋白分子量;0.1 mM的IPTG,30℃诱导表达4 h为目的蛋白最佳表达条件,经Ni2+柱纯化的蛋白浓度为1.1 mg/mL;Western Blot结果显示ORF160与抗His-tag抗体特异性结合,说明成功表达目的蛋白;以纯化ORF160制备鼠单抗,共筛选出三株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株:2B9（6 400×）、2G10（6 400×）和3E9（3 200×）;特异性实验表明,三种抗体对目的蛋白具有特异性,初步建立检测ORF160的免疫学方法,检测限不高于1.25μg/mL。本实验成功构建原核表达载体orf160-pET-B2M,表达纯化ORF160蛋白;成功制备出抗ORF160鼠单抗,初步建立能够用于检测ORF160的免疫学检测方法。本研究为探究orf160与棉花CMS的相关性奠定基础。
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