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杂草与农作物竞争水分、养料和光照,影响农作物的产量和品质,还是许多病虫害的中间寄主或越冬场所,通过除草剂来控制杂草已经成为现代农业不可缺少的一部分。但除草剂在消灭杂草的同时也对作物产生了伤害作用。目前,利用基因工程手段培育抗除草剂的作物品种解决了这一矛盾。
草甘膦(Glypphosate)是广谱、非选择性除草剂“RoUndup”(农达)的主要成分,能够抑制植物芳香族氨基酸合成途径中的关键酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性,通过转入外源编码EPSPS的基因可提高植物对草甘膦的抗性。
农杆菌介导法是目前玉米遗传转化的主要方法之一,具有能转移大片段DNA,整合的外源基因拷贝数较少,并且基因重排频率较低等优点。虽然国外已建立了基于玉米模式种质A188自交系和Hi-Ⅱ杂交种的高效的农杆菌介导的遗传转化体系,但是没有建立具有生产价值的优良玉米自交系的农杆菌介导的遗传转化体系,还存在转化频率低,重复性较差,随机性大等问题,转基因成功的事例还不十分普遍。因此建立基于国内优良玉米自交系的高效的农杆菌介导的遗传转化体系,对于促进玉米转基因育种和基因的功能研究具有重要意义。
本研究将来源于微生物的EPSPS编码基因G2-aroA单独或者与豌豆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因叶绿体前体蛋白信号肽ssu连接后,由CaMV35S启动子驱动分别转化烟草,检测G<,2>-aroA基因的抗草甘膦功能;将EPSPS编码基因G<,2>-aroA与信号肽SSU连接后,由玉米泛素基因启动子Ubiquitin驱动,通过农杆菌介导法,转化玉米优良自交系齐319和R18-599;对农杆菌介导的玉米遗传转化体系进行了一系列优化。主要结果如下:
1.将单独的G<,2>-aroA基因和连接有信号肽的G<,2>-aroA基因(ssu-G<,2>-aroA)分别转化烟草。结果表明: ssu-G<,2>-aroA转基因烟草植株、G<,2>-aroA转基因和非转基因烟草植株对草甘膦的抗性分别为:5.0mM、4.0mM、2.0mM。转基因烟草植株对草甘膦抗性高于非转基因烟草植株,而转SSU-G<,2>-aroA基因的烟草植株对草甘膦的抗性高于转G<,2>-aroA基因的植株。表明G<,2>-aroA基因提高了烟草植株对草甘膦的抗性,而且叶绿体引导肽.ssu使转G<,2>-aroA基因的烟草植株的草甘膦抗性得到进一步提高。
2.将ssu-G<,2>-aroA基因通过农杆菌介导法转化国内优良玉米自交系齐319和R18-599,得到转基因T<,0>代果穗。对T<,0>代植株进行了PCR、PCR-Southern以及RT-PCR检测,结果表明:外源基因SSU-G<,2>-aroA已经稳定整合到了玉米基因组中,而且在RNA水平上得到表达。
3.对农杆菌介导的玉米遗传转化体系进行了优化研究。于农杆菌侵染并共培养3天后对GUS基因的瞬时表达率进行检测,优化遗传转化体系。以EHA105菌株侵染玉米优良自交系齐319幼胚的研究表明.侵染液的最佳侵染状态为菌液振荡培养2小时后加入抗生素,继续振荡培养6-8小时,侵染前再加入乙酰丁香酮;侵染液最佳浓度OD<,600>为0.4-0.6;最适合用于转化的幼胚大小为直径1.5mm左右;最佳侵染时间为20分钟;潮霉素筛选临界浓度最高为5ag/L。以玉米自交系R18-599和齐319幼胚诱导的胚性愈伤为转化受体的研究表明:愈伤组织的生长状态对转化效率有很大影响,以愈伤组织继代两次、预培养一周左右为侵染的最佳时期;最佳共培养条件以共培养基中添加200mg/L的AS、共培养pH值为5.2、25℃共培养3天,另外,EHA105菌株对玉米自交系齐319愈伤的侵染效果要好于对R18-599,其平均GUS瞬时表达率分别为31.20%和23.74%,经t测验达显著水平(t<0.05)。