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CD14为白细胞分化抗原14，是革兰氏阴性菌内毒素LPS的高亲和受体。CD14能够识别且结合LPS，参与革兰氏阴性菌的消化和吞噬作用，触发机体产生免疫应答。为研究CD14基因在体内的表达抑制对相关基因表达及动物个体发育影响、建立抗革兰氏阴性菌小鼠模型，本研究利用已筛选并进行抑制效果验证的CD14基因shRNA片段，构建真核表达载体，通过原核注射法制备转CD14基因shRNA转基因小鼠，对转基因小鼠进行分析鉴定。鉴于真核表达载体制备转基因动物效率不高的问题，本研究还初步探讨了慢病毒载体法制备转基因小鼠相关影响因素及其对转基因效率的影响，为高效制备慢病毒介导的转基因小鼠奠定基础。
1.原核注射法生产转CD14基因shRNA小鼠模型
选择已筛选并进行抑制效果验证的CD14基因shRNA片段，将其连接插入pSlience4.1-CMV neo载体中，同时连接插入hEF1a-EGFP-IRES-neo-pA片段，构建真核表达载体pSilencer4.1-CD14 shRNA-IRES。采用原核注射的方法得到37只原代小鼠（F0代），经PCR鉴定，3只为转基因阳性鼠。通过扩繁获得33只F1代小鼠，经PCR、Southern-blotting检测发现，11只为转基因阳性。采用组织切片法，对F1代部分小鼠的主要脏器进行了分析，结果发现，外源转EGFP标记蛋白在肝脏、肾和脾脏表达，且在脾脏的表达量最高。说明获得的为嵌合体转基因小鼠。采用实时荧光定量PCR方法检测F1代转基因小鼠CD14基因的表达，结果显示，相对于阴性小鼠，CD14基因在转基因阳性小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织表达分别降低了8倍、3倍、19.5倍、6倍和11倍，表明转基因阳性小鼠体内，CD14基因shRNA对部分组织中的CD14基因表达具有显著的抑制作用。
2.CD14基因shRNA慢病毒载体对小鼠胚胎发育及转基因效率的影响
采用两种水牛CD14基因shRNA的慢病毒表达载体pSicoR-GFP-buffalo-U6-shRNA、pSicoR-GFP-human-U6-shRNA，通过卵周隙注射法探讨病毒滴度、注射时期、不同U6启动子的慢病毒载体对小鼠胚胎发育及转基因效率的影响。结果显示:1×106 IU/mL～1×109 IU/mL滴度的病毒均能感染小鼠胚胎，4组间胚胎的分裂率无显著差异(P＞0.05)，1×106 IU/mL、1×107IU/mL、1×108 IU/mL组的囊胚率也无显著差异(P＞0.05)，1×109 IU/mL组的囊胚率显著低于其他三组(P＜0.05)，各组囊胚转EGFP基因阳性率差异显著(P＜0.05)，感染小鼠胚胎较合适的慢病毒滴度为1×108 IU/mL。当用慢病毒感染1-细胞和2-细胞期胚胎时，两组间的胚胎分裂率、囊胚率、囊胚阳性数均无显著差异(P＞0.05)，2-细胞注射组的胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚阳性数均比注射1-细胞组的高，表明注射小鼠胚胎的较佳时期以2-细胞期较好。采用水牛源U6和人源U6启动子病毒注射1-细胞期小鼠胚胎时，两组间的胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚阳性率均无显著差异(P＞0.05)，但人源U6启动子组的囊胚阳性率高于水牛源U6启动子组(96.4％ VS83.5％)。两种U6启动子注射组所得囊胚的EGFP表达实时荧光定量PCR检测结果发现，人源U6组囊胚的EGFP表达量是水牛源U6组的5.6倍，表明含有人源U6的慢病毒载体结构的整合效率高于水牛源U6的慢病毒载体结构。
结论:原核注射法获得的CD14基因shRNA转基因小鼠可稳定遗传外源基因，其内源CD14基因表达显著下降;CD14基因shRNA慢病毒表达载体适宜的是含有人源U6启动子的慢病毒载，感染小鼠胚胎的适宜阶段是2-细胞期，适宜浓度是1×108 IU/mL。