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目的:抗体识别并与相应抗原特异性结合的能力,是机体抵御和清除外界入侵的重要手段。而抗体针对抗原特异性结合的能力和高度的亲和力,使抗体在疾病的诊断和治疗方面具有无可比拟的优势。抗体药物从发展到现在,经历了多克隆抗体,单克隆抗体,基因工程抗体三个阶段。多克隆抗体,作为多个B细胞内产生的混合型抗体,对抗原的亲和力高,但特异性不好。1975年杂交瘤细胞技术问世,人们可以制备出具有很好特异性的单克隆抗体。但这些单克隆抗体主要来自鼠源,此种异源性使得机体会产生排斥反应。近年,更多研究的是基因工程抗体—又称重组抗体,是利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行改造和重组而制备的抗体,目前基因工程抗体主要包括有嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体等。通过分子生物学基因工程技术可以获得抗体,这些抗体是常规技术下不能得到的,更适合于临床的诊断和治疗。特别是利用体外筛选技术筛选全人源抗体,成为抗体药物主要发展趋势。金黄色葡萄球菌是人类感染的重要病原体,当前,金黄色葡萄球菌特别是耐药金黄色葡萄球菌MRSA引起的感染,具有很高的死亡率,已经成为了世界三大感染治疗难题之一。而金黄色葡萄球菌的α溶血素(α-HL)是已被公认的最重要的致病毒素因子。本实验通过表达纯化可溶性金黄色葡萄球菌α-HL作为抗原,并在全人源抗体库中经过富集和筛选,制备抗α-HL全人源单链抗体,为金黄色葡萄球菌感染的诊断和治疗提供新的方案。方法:提取金黄色葡萄球菌总RNA,经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,得到α-HL cDNA,再经过巢式PCR连续两次扩增得到α-HL DNA,将DNA与可溶性载体pCold-TF分别双酶切后,通过T4连接酶连接,转化E.coli TOPO 10,菌落PCR后测序验证插入基因的正确性。将测序验证正确的α-HL/pCold-TF重组质粒转化E.coli BL21,15℃低温诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证表达产物的正确性,并对表达产物SDS-PAGE进行进一步的可溶性验证。用Ni-NTA亲和纯化系统经天然纯化条件得到纯化的α-HL蛋白。将纯化的α-HL蛋白注射小鼠体内,分离心脏血清得到α-HL多克隆抗体并进行效价测定。以生物素化α-HL蛋白为抗原利用噬菌体展示技术对前期构建的天然抗体文库进行3轮富集,用ELISA检测技术从富集的单链抗体文库中筛选抗α-HL全人源单链抗体(scFv)。对检测出的α-HL全人源单链抗体阳性克隆子进行大量表达,测序验证其正确性,并用ELISA检测技术,通过对多种细菌全菌的结合反应,检测α-HL全人源单链抗体对金黄色葡萄球菌的特异性。结果:(1).α-HL蛋白的表达纯化及鉴定:从金黄色葡萄球菌成功提取出高质量,高浓度的总RNA,经RT-PCR反转录得到cDNA模板,再由PCR扩增得到的α-HL基因大小为900bp左右;经与载体pCold-TF连接,将重组质粒α-HL/pCold-TF转化E.coli BL21,经15℃低温诱导表达24h,得到可溶性的α-HL融合蛋白,融合蛋白大小为90 kDa左右(载体上的TF分子伴侣大小为45 kDa左右);经SDS-PAGE和western blot验证表达纯化的蛋白为α-HL融合蛋白。将纯化的α-HL蛋白注射BABL/C小鼠制备抗血清,结果显示抗血清与金黄色葡萄球菌结合良好,效价大于10,000倍。(2).抗α-HL全人源单链抗体筛选与表达:以生物素化α-HL蛋白为抗原,采用噬菌体展示技术对全人源抗体文库进行3轮富集,用ELISA检测方法反复筛选出α-HL全人源单链抗体阳性克隆子,将阳性克隆子大量表达后测序验证了其正确性。通过ELISA检测到筛选出的α-HL全人源单链抗体对金黄色葡萄球菌具有良好的特异性。结论:成功对α-HL进行了基因克隆,并成功表达纯化到可溶性的α-HL融合蛋白。成功筛选到有较高特异性的α-HL全人源单链抗体。