【摘 要】
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用化学合成的方法合成INUA、INUB、INUC三个先导肽DNA片段, 经BamHI和EocRI酶切后,与同样双酶切处理的质粒pPIC3.5K重组构建得到一个套具有INU 先导序列的新型分泌型毕赤酵母
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用化学合成的方法合成INUA、INUB、INUC三个先导肽DNA片段, 经BamHI和EocRI酶切后,与同样双酶切处理的质粒pPIC3.5K重组构建得到一个套具有INU 先导序列的新型分泌型毕赤酵母表达系统即pPICINUA,pPICINUB,pPICINUC.设计并合成一对引物, 用PfuDNA聚合酶从大肠杆菌基因组上PCR扩增出天冬酰成熟肽基因序列(简称ASN序列), 经EcoRI酶处理后插入pPICINUA和pPIC9K中,得到表达质粒pPICINUA-ASN和pPIC9K-ASN,将这两个表达质粒与空白质粒pPIC9K经SacI酶切线性化后用原生质体法转化入Pichiapastoris的GS115菌株中, 经过筛选得到5个Mut<+>型菌株即GS115/INUA-ASN0.25、GS115/INUA-ASN4.0、GS115/9K-ASN0.25、GS115/9K-ASN4.0和GS115/pPIC9K,将这五个菌株与GS115/β-Gal一起用甲醇培养基诱导表达,检测发酵液中的天冬酰胺酶活,并用SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分泌到培养液中的蛋白质.
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