论文部分内容阅读
【背景】肿瘤生长和转移过程依赖于新生血管的形成，抑制肿瘤血管形成及增生就成为肿瘤成像和治疗的有效靶点。在过去的几十年中，大量的工作都集中于研究发现血管生成抑制剂。由于目前的血管生成抑制剂多分子量较大、结构复杂、成本偏高等原因，其应用受到较大程度地限制。短肽具有良好的组织渗透性、代谢稳定性及可耐受多种修饰等特点，以短肽为基础的肿瘤血管靶向治疗成为研究的热点。聚乙二醇化、脂质体包被及与放射性核素螯合形成络合物是短肽常用的修饰方式。将肿瘤靶向性短肽进行放射性核素标记治疗肿瘤，既可以特异持久的杀伤肿瘤细胞，又可避免损伤正常组织及器官，具有毒副作用小、不易产生耐药性等优势。目前，多种利用短肽制备的放射性靶向药物正在研究中，而且一部分药物已经进入临床试验阶段。前期工作中，我们实验室应用噬菌体环七肽库筛选出能够与肿瘤血管特异结合的短肽GEBP11,成功标记131I后制备形成131I-GEBP11，动物实验显示出良好的抗瘤作用，并且有较轻的毒副作用。但GEBP11短肽仍有一些不足，如循环半衰期短、受体亲和力不够强、瘤内浓聚度欠佳等，因此131I-GEBP11的成药性尚不理想。本研究拟采用化学修饰的方法提高该短肽的循环半衰期及受体亲和力，并应用修饰后的短肽2PEG-（GEBP11）<sub>3制备同位素探针进行放射性成像及治疗，旨在为开发安全高效的胃癌血管靶向治疗药物提供候选分子。【目的】1.化学合成2PEG-（GEBP11）3多聚体短肽并鉴定其受体亲和力、结合特异性。2.制备2PEG-（GEBP11）3多聚体短肽同位素探针，并鉴定其体内肿瘤血管靶向性，评价其在肿瘤多模态成像和放射性靶向治疗中的价值。【方法】1.利用叉形PEG合成三聚体短肽2PEG-（GEBP11）3，应用质谱进行鉴定；应用Iodogen方法131I直接标记GEBP11及2PEG-（GEBP11）3，并进行标记率、放射化学纯度及稳定性分析；细胞免疫荧光进一步鉴定GEBP11短肽与Co-HUVECs结合的特异性；竞争性结合实验及放射自显影比较鉴定2PEG-（GEBP11）3、GEBP11短肽与Co-HUVECs的亲和力差异。2.利用2PEG-（GEBP11）3及GEBP11短肽制备同位素探针进行SPECT和切伦科夫成像以及生物学分布测定，比较两种放射性示踪剂在荷瘤鼠体内肿瘤血管靶向性的差异。3.比较放射性131I标记的GEBP11及2PEG-（GEBP11）3短肽对Co-HUVECs及荷瘤鼠肿瘤的抑制作用；病理学H&E染色、免疫组织化学及TUNEL实验检测治疗后肿瘤组织的细胞凋亡及血管数量的改变。【结果】1.质谱结果确定应用叉形PEG合成的短肽为2PEG-（GEBP11）3。细胞免疫荧光显示GEBP11短肽可特异地与Co-HUVECs结合，而在HUVECs、SGC7901细胞上呈阴性或弱阳性反应。应用直接法将131I标记GEBP11及2PEG-（GEBP11）3，纸层析法测定其标记率达93-98%，比活度大于10Ci/mmol；将放射性标记的GEBP11短肽室温下放置，与血清、生理盐水、半胱氨酸及EDTA分别混合孵育，24小时后各混合液的标记率均大于83%，表明放射性标记的GEBP11短肽在体内外具有良好的稳定性。竞争性结合实验及放射自显影显示2PEG-（GEBP11）3较单体GEBP11与Co-HUVECs具有更高的亲和力，且该标记过程对短肽的亲和力无明显影响。2.将放射性核素131I标记的GEBP11注入到荷瘤鼠体内，进行多模态成像及动态观测，在荷瘤鼠肿瘤部位可见有放射性浓聚灶，且131I-2PEG-（GEBP11）3在荷瘤鼠的肿瘤部位浓聚性最高，4h时显影最清晰，而131I-URP对照组无肿瘤部位的特异性浓聚。生物学分布结果显示131I-2PEG-（GEBP11）3在肿瘤组织的放射性高于胃肠、肌肉等正常组织，肿瘤组织4h的放射性为2.22±0.13%ID/g，24h后缓慢降至1.61±0.05%ID/g，而131I-2PEG-（GEBP11）3在正常组织器官很快清除。3.体外细胞毒性和细胞凋亡实验显示放射性标记的GEBP11短肽可产生细胞毒及细胞凋亡作用，呈浓度依赖性，且131I-2PEG-（GEBP11）3的作用较强，Na131I对Co-HUVECs无特异性细胞凋亡及杀伤作用。抑瘤结果显示131I-2PEG-（GEBP11）3的肿瘤抑制作用最强，其次为131I-GEBP11,而131I-URP有轻微的抑瘤作用。与对照组相比，131I-GEBP11治疗组裸鼠的生存时间从35天延长为51天，131I-2PEG-（GEBP11）3治疗组裸鼠的生存期延长为75天。免疫组织化学结果显示，与对照组相比，放射性标记的GEBP11短肽治疗组肿瘤部位血管数量减少，以131I-2PEG-（GEBP11）3治疗组肿瘤血管数量减少明显。H&E染色及TUNEL实验显示131I-2PEG-（GEBP11）3治疗后瘤内可见大片状坏死，131I-GEBP11治疗后瘤内可见局灶性小片状坏死；而131I-URP及对照组肿瘤细胞生长良好。各治疗组无明显肝肾毒性。【结论】1.应用Iodogen直接法标记GEBP11短肽，获得标记率、比活度高，稳定性良好的放射性探针，且131I-2PEG-（GEBP11）3与胃癌血管内皮细胞的亲和力、特异性高于131I-GEBP11。2.与131I-GEBP11相比，131I-2PEG-（GEBP11）3具有更高的肿瘤血管靶向性，可特异性的聚集在肿瘤部位，其体内半衰期明显延长，能显著抑制肿瘤生长，无明显肝肾毒副作用。因此131I-PEG-（GEBP11）3有望成为胃癌血管放射性靶向治疗的候选分子。