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研究目的:
大量动物和体外实验证明,热量限制(CR)不仅能延缓衰老,维持许多年轻时的生理状态,并且能延缓和预防一些与年龄相关疾病的发生发展。另外,运动可以形成骨骼肌从结构到功能的重塑,肌球蛋白重链(myosine heavy chain,MyHC)亚型的适应性变化是其中一个重要环节。本研究通过限制培养基中的葡萄糖浓度,来建立CR的骨骼肌C2C12细胞模型,在此模型基础上探讨CR和模拟训练的电刺激两个因素对肌纤维不同亚型发育和表达以及糖代谢的影响,为CR抗氧化损伤、减缓肌力下降和运动训练提供一定的理论基础。
研究方法:
分别研究了含5 mM和25 mM葡萄糖的DMEM(Dulbeccos modifiedEagle medium,DMEM)培养基对C2C12成肌细胞(C2C12 myoblasts in DMEMat5 mM glucus,CB5;C2C12 myoblasts in DMEM at25 mM glucus,CB25)增殖、总蛋白合成、三磷酸腺苷(Adenosine triphophate,ATP)合成、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase,SOD)的影响。在细胞分化后5天,加入含5 mM和25 mM的葡萄糖的分化培养基(differentiation medium,DM)孵育,检测不同糖浓度对骨骼肌C2C12细胞肌管(C2C12 myotubes in differentiation medium at5mM glucus,CT5;C2C12 myotubes in differentiation medium at25 mM glucus,CT25)SOD活性、ATP合成的影响,为建立CR的C2C12细胞模型提供依据。检测了5 mM和25 mM两个糖浓度对C2C12肌管MvHC肌纤维不同亚mRNA的表达,以及糖原和糖转运载体蛋白4(GLUT4)mRNA的表达。在细胞分化五天后,加入不同分化培养基48 h后,开始90 min的一次性电刺激(45 V,20 ms,5 HZ),刺激后即刻收样(90 min electric stimulation,E90)检测MyHC不同亚型以及GLUT4 mRNA表达的影响。对细胞分化五天后的另外一批细胞,加入5 mM和25 mM两个糖浓度的DM,孵育48 h,48 h内在每天的同一时间进行两次45 min的电刺激,同时48 h后进行90 min的电刺激后即刻收样(two times of45 min electric stimulation and90 min electric stimulation,E45)检测MyHC不同亚型mRNA的表达。
研究结果:
1.模型建立
(1)各浓度的细胞均出现了典型的生长曲线。以初始浓度为2000/孔和3000/孔的细胞在培养2-3天后进入对数生长期,而1000/孔组的细胞在移殖后4-5天才开始对数增长。选择2000细胞/孔移殖浓度,小皿的种植密度为3×104个/皿。CB5的细胞增殖速率显著小于CB25(P＜0.05)。
(2)CB5和CB25组蛋白合成都呈增长趋势,但CB5的蛋白增长趋势不如CB25明显。
(3)无论是在C2C12增殖期还是分化期,5 mM的葡萄糖浓度处理组的ATP合成和SOD的活性均高于25 mM对照组,并且具有极显著性差异(P＜0.01)。
2.CR对C2C12肌管MvHC不同亚型和GLUT4mRNA表达的影响
(1)分化5天后的肌管加入不同的DM处理48 h后,CT5的MyHCI慢肌与MyHCIIa、MyHCIIb和MyHCIIx等快肌的mRNA表达显著低于CT25(P＜0.01)。
(2)分化5天后的肌管加入不同的DM处理48 h后,CT5的糖转运载体蛋白4(GLUT4)mRNA的表达显著低于CT25(P＜0.01)。
3.电刺激对MyHC亚型及GLUT4表达的影响
(1)电刺激E90对MyHC亚型的转变在趋势上呈一致性,慢肌表达下调,MyHCIIa下调,MyHCIIb和MyHCIIx表达上调,有慢肌向快肌转化趋势。另外,电刺激E90均上调GLUT4的表达。
(2)电刺激E45对MyHC不同亚型的转变趋势不太一致,CT25快肌表达下降(MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx),慢肌表达上升,CT5快慢肌的表达均上升,均有显著性差异。
结论:
(1)降低培养的C2C12成肌细胞和肌管的葡萄糖均引起增殖能力下降和蛋白合成降低,引起SOD酶的活性和胞内ATP水平上升。
(2)降低培养C2C12肌管的葡萄糖引起糖原合成降低,引起GLUT4和肌纤维的mRNA表达降低。
(3)电刺激E45引起CT5快慢肌的mRNA表达均上升,引起CT25快肌表达是下降的但慢肌表达上升。
(4)电刺激E90引起C2C12肌管慢肌向快肌转化,上调了GLUT4 mRNA的表达的。