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胶原蛋白在动物组织中含量丰富,约占总蛋白质含量的30%。由于其独特的理化性质,胶原蛋白已被广泛应用于各种领域,如:医疗器械、化妆品、皮革、生物医学、应用化学、功能性食品等。本论文以罗非鱼皮为原料提取酸溶性胶原蛋白,研究所提胶原蛋白的理化性质,在此基础上利用静电纺丝技术将所提胶原蛋白制备成复合支架材料,并对其理化性质、生物活性和免疫原性进行研究。 在单因素实验的基础上,以罗非鱼皮为原料,胶原蛋白提取率为指标,运用响应面设计优化实验条件,得出乳酸提取罗非鱼皮胶原蛋白的优化工艺参数为:乳酸溶液pH2.1、液固比65∶1(mL/g)、提取时间44 h,在此条件下胶原蛋白的提取率为85.57%。 对提取的罗非鱼皮胶原蛋白的理化性质进行分析。结果表明,胶原蛋白由三条不同的多肽链链组成(α1链、α2链、β链),甘氨酸为罗非鱼皮胶原蛋白的主要氨基酸,亚氨基酸含量占16.9%,最大紫外吸收值为232 nm且280nm处无吸收,表明所提取胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白。红外光谱扫描结果表明所提取的罗非鱼皮胶原蛋白完整的保留了三股螺旋结构,其变性温度为32.56℃,其流变学特性主要表现为粘性性质,呈现出纤维和空间网状结构的微观形态。 利用静电纺丝技术将罗非鱼皮胶原蛋白与聚己内酯复合制成聚己内酯/胶原蛋白支架材料,并对其理化特性及其生物活性进行研究。结果表明,随着胶原蛋白含量的增加,支架材料的纤维直径从987±274 nm减至689±299 nm。制备的支架材料结晶度较低且结晶尺寸较小,且具备聚己内酯和胶原蛋白的双重特性,聚己内酯/胶原蛋白支架材料的热变性温度(50-60℃)比罗非鱼皮胶原蛋白(32.74℃)高。随着支架材料中胶原蛋白含量的增加,支架材料的极限抗张强度也随之增加。圆二色谱和体外降解分析表明支架材料稳定性较好且降解率较小。通过细胞毒性分析(MTT法)和扫描电子显微镜(SEM)、激光共聚焦显微镜(LSCM)观察支架材料上细胞的行为,结果表明所制备的支架材料能为L929细胞的生长、粘附提供合适的环境,具有良好的生物相容性,尤以含8%胶原蛋白的的复合支架材料为最佳。 将聚己内酯/胶原蛋白复合支架材料植入SD大鼠体内,考察支架材料的免疫原性。结果表明,除脾细胞培养上清液中白介素-2水平基本保持不变外,脾细胞培养上清液中干扰素-γ,血清中干扰素-γ,肿瘤坏死因子-α和-γ、外周组织分泌液中白介素-6和白介素-10水平在植入一周后均显著减小。血清中总免疫球蛋白G抗体也从植入后1周时的18.5±2.29 mg/mL降为4周时的9.84±1.78 mg/mL。植入部位的组织形态学和免疫组织化学结果表明植入聚己内酯/胶原蛋白复合支架材料后的早期有明显的炎症反应,到第4周时炎症反应已基本消失。取回植入大鼠体内的支架材料进行SEM分析,成纤维细胞明显的增多。因此静电纺丝法制备的聚己内酯/胶原蛋白复合支架材料可以作为组织工程支架的良好来源。