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目前研究发现，恶性肿瘤是由一小群具有自我更新能力和多向分化潜能的癌细胞引起和维持的。这一小群癌细胞被称为肿瘤干细胞（Cancer stem cell）或肿瘤启动细胞（Tumor initiating cell），它们与肿瘤的发生、发展、转移、抵抗化疗和放疗杀伤密切相关。自我更新是肿瘤干细胞区别于普通癌细胞最重要的特征之一，也是肿瘤干细胞维持自身“干性”并最终引起肿瘤转移和复发的根本原因。然而，肿瘤干细胞自我更新的调控机制仍未完全阐明。miRNA是一类近年来新发现的长约19-22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通常在转录后水平调控靶基因蛋白表达。目前研究发现，miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要的调控作用。成为一类新型的癌基因或抑癌基因。肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移、耐药、复发等多种生物学过程都与miRNA密不可分。虽然miRNA的序列很小，但是一个miRNA可以调控多个基因，形成序列放大的基因调控通路；也可以受很多基因的调控，从而在生物体内构成了一个庞大的复杂的基因调控网络。大量研究证明，miRNA也参与了干细胞和肿瘤干细胞自我更新和多向分化潜能性的调节。例如MiR-21、miR-134、miR-470通过靶向自我更新相关基因nanog、SOX2、OCT4调节胚胎干细胞的自我更新及分化。Let-7调控乳腺癌干细胞的自我更新和增殖等。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，因此，我们的问题是：胃癌干细胞的自我更新是如何被调控的呢？它们是否与miRNA有关呢？如果是，又有哪些miRNA调控了胃癌干细胞的自我更新和增殖呢？它们参与胃癌干细胞自我更新和增殖是通过怎样的机制完成的？对指导临床工作又有怎样的意义？这些问题成为本课题研究的内容。【目的】1、寻找与胃癌干细胞自我更新相关的miRNA；2、明确候选miRNA调控胃癌干细胞自我更新和增殖的作用；3、探讨候选miRNA在胃癌组织中的表达及其临床意义。【方法】1、利用tumorsphere实验和EpCAM+/CD44+胃癌表面标记物富集胃癌干细胞并进行验证；2、利用细胞培养使胃癌干细胞贴壁分化，收集分化8小时、12小时、24小时和8天的细胞送miRNA芯片检测，寻找表达逐渐缺失的miRNA分子，并利用Real-time PCR验证芯片结果；3、构建miRNA分子的慢病毒正义表达载体，分别感染胃癌细胞系并构建筛选稳定转染细胞；4、利用tumorsphere实验和NOD-SCID鼠成瘤实验分别检测miRNA对胃癌干细胞自我更新的影响；5、利用MTT实验、平板克隆形成试验、裸鼠成瘤实验等技术研究miRNA对胃癌细胞增殖的影响；6、利用生物信息学数据库寻找miRNA促进胃癌细胞增殖和自我更新的靶基因，并通过报告基因实验和Western Blot进行验证；7、利用real-time PCR检测胃癌组织标本内miRNA的表达并分析其与临床病理资料的关系。【结果】1．EpCAM+/CD44+标记物和tumorsphere肿瘤球形成实验能够富集胃癌干细胞2011年，Han ME等人从胃癌临床标本内鉴定出胃癌干细胞的细胞表面标记物是EpCAM+/CD44+。为了检测在胃癌细胞系内EpCAM+/CD44+的细胞是否也是胃癌干细胞，我们比较了两个EpCAM+/CD44+含量完全相反的细胞系在无血清低粘附培养条件下的肿瘤球形成能力。在胃癌细胞系SGC7901中，80%的细胞表达EpCAM和CD44，并且大多数SGC7901细胞能够在无血清低粘附的培养条件下形成肿瘤球，而0.2%表达EpCAM+/CD44+标记物的MKN28细胞无法在无血清低粘附的培养条件下生成肿瘤球。由于肿瘤球形成实验是在体外检测细胞自我更新能力的最佳实验，我们利用流式细胞术从胃癌细胞系内分选到了EpCAM+/CD44+细胞和非EpCAM+/CD44+细胞，并利用肿瘤球形成实验检测他们的体外自我更新能力。15天后，85-95%的EpCAM+/CD44+细胞形成了肿瘤球，而只有15-20%的非EpCAM+/CD44+细胞形成了肿瘤球。并且，EpCAM+/CD44+细胞形成的肿瘤球内的肿瘤细胞明显多于非EpCAM+/CD44+细胞。裸鼠体内成瘤实验显示，10~4EpCAM+/CD44+细胞形成的肿瘤荧光信号在第15、21和28天明显强于10~5非EpCAM+/CD44+细胞。这些结果表明EpCAM+/CD44+也是体外培养胃癌细胞系的干细胞标记物并可以用于胃癌干细胞体外研究的模型。肿瘤干细胞的一个重要的特征是多潜能性。因此我们利用上述发现检测胃癌干细胞是否能够在含有血清的普通培养条件下分化。正如我们所料，通过利用CFSE标记和流式细胞术检测，我们发现肿瘤球细胞在含有血清的培养条件下贴壁后增殖加快。利用real-time PCR检测我们发现肿瘤球细胞较贴壁的细胞表达上皮标记CK14和CK18减少，但是，他们在含有血清的培养基内贴壁分化后形态逐渐拉长，并表达较高的分化标记CK14和CK18。EpCAM+/CD44+的肿瘤球细胞在含有血清的培养条件下的潜在分化能力表明胃癌干细胞具有多潜能性，并且一定有一个独特的机制能够调节这一过程。2．miR-19b/20a/92a在胃癌干细胞分化过程中表达减低由于miRNA能够调节干细胞的自我更新和分化，我们培养了一大批富集了胃癌干细胞的肿瘤球细胞，并将这些细胞放入正常的含血清的培养基中使其贴壁分化，我们收集了分化8小时，12小时，1天和8天的细胞送miRNA芯片检测。并寻找在此贴壁分化过程中表达逐渐缺失的miRNA分子。我们认为在肿瘤干细胞贴壁分化过程中表达逐渐缺失的miRNA分子可能维持了胃癌干细胞的自我更新，因此才能在贴壁分化过程中表达逐渐减低。利用Anova分析，我们鉴定出了一些在胃癌干细胞贴壁分化过程中表达逐渐缺失的miRNA分子，其中，miR-19b/20a/92a的表达差别显著，并引起我们注意。此外，miR-106a和miR-30d等分子也与miR-19b/20a/92a有着相似的表达形式。为了验证芯片结果，我们利用real-time PCR进一步检测了miR-19b/20a/92a在胃癌干细胞和贴壁分化细胞中的表达，发现他们的确在贴壁8个小时后表达有所减低，贴壁1天后表达减低明显，8天后进一步下降。我们用同样的方法检测了miR-106a和miR-30d的表达，发现他们仍然有与miR-19b/20a/92a相似的表达形式。由于miR-19b、miR-20a和miR-92a同属于miR-17-92基因簇，我们选择了miR-19b/20a/92a进行了后续的深入研究。3．过表达miR-19b/20a/92a能够促进胃癌干细胞体外肿瘤球的形成为了检测是否miR-19b/20a/92a能够维持胃癌干细胞的自我更新，我们将慢病毒携带的miR-19b/20a/92a稳定转染入从SGC7901细胞分选的EpCAM-/CD44-细胞，并利用real-time PCR验证了转染效率。过表达lenti-miR-19b/20a/92a较对照相比能够显著增加胃癌细胞的肿瘤球形成能力，表明胃癌细胞的自我更新能力得到显著增高。此外，lenti-miR-19b/20a/92a稳定表达的细胞形成的肿瘤球内细胞数较对照组显著增高。为了避免由于相关细胞变化导致的差异，我们又从invitrogen公司购买了miR-19b/20a/92a的前体RNA和拮抗RNA，并分别瞬时转染入EpCAM-/CD44-（或MKN28）细胞和EpCAM+/CD44+（从SGC7901细胞分离），real-time PCR检测转染效率后仍然利用肿瘤球形成实验检测其对自我更新的影响。结果发现与对照组相比，瞬时转染miR-19b/20a/92a的前体RNA能够显著促进EpCAM-/CD44-和MKN28胃癌细胞的肿瘤球形成能力即自我更新能力。而瞬时转染miR-19b/20a/92a的拮抗RNA能够显著降低EpCAM+/CD44+细胞和SGC7901细胞的体外自我更新能力。我们的结果表明miR-17-92基因簇的miRNA分子通过增加胃癌细胞的肿瘤球形成数目和每个肿瘤球的细胞数来在无血清低粘附的培养条件下调节胃癌干细胞的自我更新。4．过表达miR-19b/20a/92a能够促进肿瘤球细胞对胃癌化疗药物的耐受有研究表明肿瘤干细胞能够抵抗化疗药物的作用，从而导致多药耐药的发生和继发性肿瘤复发。我们利用MTT实验检测了肿瘤球细胞在胃癌化疗药物5-FU存在下的生长曲线：与对照组病毒相比，lenti-miR-19b/20a/92a感染的细胞形成的肿瘤球在化疗药物的存在下生存时间延长。这表明miR-19b/20a/92a不仅通过增加肿瘤球细胞的数目，还通过诱导细胞对化疗药物的耐受来促进胃癌干细胞自我更新的维持。5．过表达miR-19b/20a/92a能够增加EpCAM+/CD44+细胞数由于胃癌干细胞表达细胞表面标记物EpCAM+/CD44+，我们利用流式细胞术检测是否pre-miR-19b/20a/92a转染的细胞较对照组相比表达较多的EpCAM+/CD44+细胞表面标记物。我们发现瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a能够显著增加EpCAM+/CD44+细胞数，而瞬时转染miR-19b/20a/92a的拮抗剂能够显著减低EpCAM+/CD44+细胞数。6．过表达miR-19b/20a/92a能够促进胃癌干细胞在NOD-SCID鼠中的自我更新我们进一步检测了过表达miR-19b/20a/92a对胃癌干细胞体内自我更新的影响。为了更好的评估动物体内的自我更新，我们利用本实验室前期建立的荧光素酶标记的SGC7901-Luc细胞系感染病毒并建立稳定表达miR-19b/20a/92a的细胞系，并应用real-time PCR验证miRNA表达水平。每只NOD-SCID鼠背部注射2Χ10~3lenti-miR-19b/20a/92a或者lenti-NC形成的肿瘤球。28天后，所有注射lenti-miR-19b/20a/92a细胞的NOD-SCID鼠背部均形成了肿瘤，但是只有一只lenti-NC组的NOD-SCID鼠背部形成了肿瘤（P<0.001）。并且miR-19b/20a/92a感染的细胞在注射第28天后形成的肿瘤块已经超过了3厘米，而NC组形成的肿瘤块在第49天，即实验的最终点才长到2厘米。HE染色结果表明，miR-19b/20a/92a感染的细胞在NOD-SCID鼠体内产生了肝和肺转移灶，而NC组没有转移。7．miR-19b/20a/92a促进胃癌细胞体内外的增殖干细胞调节基因一般也与细胞的增殖相关。因此，我们继而利用MTT实验，平板克隆形成实验和裸鼠成瘤实验检测了miR-19b/20a/92a在胃癌细胞体内外增殖中的功能。体外增殖实验显示：miR-19b/20a/92a稳定表达组较NC对照组促进了胃癌细胞的增殖，瞬时转染miR-19b/20a/92a的前体得到了相似的结果，而瞬时转染miR-19b/20a/92a的拮抗物得到的结果相反。为了验证体外增殖实验结果，我们利用裸鼠体内成瘤实验进一步检测miR-19b/20a/92a对胃癌细胞增殖的影响。我们利用实验室前期建立的带有荧光标记的细胞系SGC7901-Luc稳定转染lenti-miR-19b/20a/92a及lenti-NC，real-time PCR验证表达后，分别注射入裸鼠体内，结果显示裸鼠成瘤能力miR-19b/20a/92a注射组较NC组显著增高。8．miR-19b/20a/92a通过在转录后水平靶向E2F1和HIPK1并激活β-catenin信号转导通路来促进胃癌干细胞的自我更新利用生物信息学数据库MiRanda查询miR-17-92的靶基因，结果显示人类E2F1存在两个与miR-20a结合的保守区域，而人类HIPK1各存在一个与miR-19b和miR-92a结合的保守区域。有研究表明miR-20a能够靶向E2F1并且能够反之诱导miR-17-92基因簇的表达。为了进一步证实这些靶向位点，我们构建了人类E2F1和HIPK1的3’非翻译区结合位点并进行了报告基因实验。结果表明，miR-19b和miR-92a能够与HIPK1的3’非翻译区结合，而miR-20a能够与E2F1的3’非翻译区结合。Western Blot实验进一步证实了这一点。9．miR-92a能够做为独立的预测胃癌预后的miRNA分子为了检测miR-17-92基因簇对胃癌干细胞的调控是否具有临床意义，我们检测了95例胃癌组织标本内miR-19b/20a/92a的表达并分析了其与胃癌临床病理资料和患者预后的关系，发现miR-20a和miR-92a的表达与胃癌患者的预后呈负相关关系，并且miR-92a能够做为独立的预测胃癌预后的指标。【结论】本研究揭示了miR-17-92基因簇在胃癌干细胞自我更新和增殖中的新功能。miR-19b/20a/92a的高表达能够促进胃癌干细胞的自我更新和胃癌细胞的增殖，这主要是通过靶向HIPK1和E2F1，激活wnt-β-catenin通路从而增加EpCAM+细胞数实现的。此外，miR-92a能够做为独立的预测胃癌预后的miRNA分子，为临床胃癌的诊断和治疗提供了方向。