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目的：利用定点突变技术对HIF-1α进行定点突变获得常氧下稳定表达的HIF-1α突变体，构建携带HIF-1α基因的重组慢病毒，为下一步感染靶细胞并在体内外获得长期、稳定的表达打下基础；探讨HIF-1α修饰骨髓间质干细胞移植对脑缺血大鼠神经功能恢复的影响及其可能的作用机制。
方法：以pCDNA3.1-HIF-1α—P402A作为模板对HIF-1α的564、803位点进行定点突变，获得pCDNA3.1-HIF-1α—P402A—P564G—N803A质粒，经KpnⅠ和BamHⅠ酶切下目的基因HIF-1α—P402A—P564G—N803A片段，回收纯化并克隆至pEGFP—N2获得pHIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。将HIF-1-P402A—P564G—N803A—EGFP片段定向克隆至pENTR/D—TOPO中，构建成Gateway入门载体pENTR—HIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。应用Gateway LR重组反应将Gateway入门载体中目的基因转入Gateway终载体pLenti6/V5-DEST中，构建成突变型HIF-1α慢病毒载体pLenti6/V5-HIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。将慢病毒载体与慢病毒包装系统共转染293FT细胞，收获并纯化病毒液；利用第一部分成功收获并纯化的病毒液感染BMSCs，获得稳定转染HIF-1α的BMSCs后，通过RT—PCR和western blot的方法检测HIF-1α在常氧下的表达情况，同时检测HIF-1α下游靶基因EPO，VEGF和CXCR4在mRNA水平的表达。大鼠在成功制作大脑中动脉阻塞模型后随机分为三组：BMSCs—mHIF-1α移植组，BMSCs—EGFP移植组和PBS对照组。在缺血后3h经股静脉进行体内移植。在细胞移植后的1，7，14，28天进行神经功能检查。TTC染色观察缺血体积。通过TUNEL分析缺血侧脑组织的细胞凋亡数目。使用pax6、DCX抗体免疫荧光双标的方法检测内源性神经干细胞并定量分析pax6/DCX双阳性细胞的数目以观察内源性神经干细胞在各实验组的增殖、存活情况。
结果：经过各个步骤的鉴定，成功构建了携带HIF-1α基因的重组慢病毒，病毒滴度为3.36×108 TU/ml；常氧状态下，BMSCs—mHIF-1α与BMSCs—EGFP相比，HIF-1α在mRNA及蛋白水平上的表达均上调，其下游基因EPO，VEGF和CXCR4 mRNA水平上的表达也明显增加。细胞移植后的14天和28天，BMSCs—mHIF-1α移植组较BMSCs—EGFP移植组和PBS对照组神经功能恢复明显改善。脑缺血后3天，BMSCs—mHIF-1α移植组脑梗死灶体积较BMSCs—EGFP移植组和PBS对照组明显减少。在细胞移植后7天，两细胞移植组的凋亡细胞数量在缺血侧大脑半球皮质区没有明显差异；而在海马区，BMSCs—mHIF-1α移植组凋亡细胞数量明显少于与BMSCs—EGFP移植组(P<0.05)；在细胞移植后14天，BMSCs—mHIF-1α移植组凋亡细胞数量在海马区和皮质区均少于BMSCs—EGFP移植组(P<0.05)。细胞移植后7天，BMSCs—mHIF-1α移植组在海马区域观察到pax6/DCX细胞数量明显多于BMSCs—EGFP移植组和PBS对照组(P<0.05)。
结论：①通过定点突变技术对HIF-1α基因进行定点突变，获得常氧状态下稳定表达的突变型HIF-1α；HIF-1α表达上调诱导其下游靶基因的表达。②慢病毒介导HIF-1α基因修饰骨髓间质干细胞移植能显著改善脑缺血大鼠神经功能、减少缺血体积，其治疗机制可能与HIF-1α基因修饰BMSCs移植减少缺血半暗带区神经细胞的凋亡，增加缺血侧大脑半球内源性神经干细胞数量有关。