论文部分内容阅读
要研究根瘤菌与土著菌的竞争及消长关系,或明确某一特定根瘤菌的占瘤率和结瘤率等,只有借助于标记技术使目的菌具有示踪特性,方能检测,方便研究。为获得红色荧光蛋白质粒RFP(Red flouoresent protein)、黄色荧光蛋白质粒YFP(Yellow flouoresent protein)和绿色荧光蛋白质粒GFP(Green flouoresent protein)能够稳定表达和传代的根瘤菌标记菌株,本研究采用以滤膜为载体的经典三亲本杂交方法,将不同颜色荧光蛋白RFP、YFP和GFP质粒,成功导入辅助菌大肠杆菌中,以此为基础进行构建和稳定性验证,并通过对荧光标记菌分别接种于紫花苜蓿甘农5号(Medicagosativa cv.Gannong No.5)和紫花苜蓿S.343(Medicagosativa cv.S.343)中,测定接种苜蓿幼苗的地上及地下部鲜重、干重,以及根长、株高、叶片数、叶面积、单株结瘤数、固氮酶活性、根瘤等级、占瘤率和叶片叶绿素含量等生长及生理指标,测试接种三种荧光标记菌及其出发菌对苜蓿幼苗产生的影响,取得以下结果:1、众多研究结果表明热激转化可以用于质粒蛋白的转导,并获得与大肠杆菌的结合。本研究中,以传统的热激转化处理,三种颜色的荧光蛋白质粒均能与大肠杆菌稳定结合,表明热激转化法适合红、黄、绿荧光蛋白与大肠杆菌的转移接合。2、通过三亲本杂交,三种不同颜色的荧光蛋白质粒在辅助大肠杆菌的作用下均能成功地从供体大肠杆菌转移到受体根瘤菌中。三亲本杂交的载体为辅助菌大肠杆菌,对受体菌荧光蛋白质粒的转移起到了很重要的作用,不同的受体菌也会影响三亲本杂交的接合效率,本研究中,GFP荧光菌株转移接合率最高,与RFP和YFP差异显著(P<0.05),荧光质粒的丢失率也较低为2%-4%,表明绿色荧光质粒在苜蓿荧光根瘤菌构建方面具最优的选择条件。3、分别接种三种颜色荧光标记根瘤菌后,两个品种苜蓿幼苗的根鲜重、根干重、地上部分鲜重和干重、根长、株高、根瘤菌固氮酶活性和叶绿素含量均显著(P<0.05)高于未接种处理;荧光标记根瘤菌与其对应的出发菌相比,能在植株体内稳定表达,未对苜蓿幼苗产生不良影响,具有与出发菌相近的促生能力。这表明构建的三种荧光蛋白质粒根瘤菌可有效的促进植株的生长和生物量的积累,并不影响根瘤菌的结瘤竞争能力和促进生长效应。